جعل التصحيح ، وماصات أقطاب شارب مع بولير برمجة

أصبحت الماصات الشعرية الزجاجية منتشرة في المختبرات لمجموعة واسعة من التقنيات، مثل التثقيب الكهربائي للخلية الواحدة، والحقن المجهري للحمض النووي DNA، والفيزيولوجيا الكهربائية بتقنية تثبيت الرقعة (patch clamp). لتحضير أقطاب تثبيت الرقعة الشعرية الزجاجية من أجل التسجيلات، يتم سحب الزجاج السيليكاتي باستخدام جهاز سحب قابل للبرمجة. تُطلى رؤوس الأقطاب بالشمع، ثم تُصقل هذه الرؤوس بالحرارة وتُخزن لاستخدامها مستقبلاً. مرحباً، أنا ميريام غودمان من قسم الفيزيولوجيا الجزيئية والخلوية بجامعة ستانفورد.

سأقوم في هذا الفيديو بتوضيح كيفية صنع ماصات تثبيت الجهد (patch clamp pipettes) والأقطاب الحادة المستخدمة في الفسيولوجيا الكهربائية. لقد كانت الأقطاب المجهرية الزجاجية، والتي تُسمى أيضاً بالماصات، الأداة الأساسية في الفسيولوجيا الكهربائية لعقود من الزمن. واليوم، يتم تصنيع هذه الماصات من الشعيرات الزجاجية باستخدام جهاز سحب قابل للبرمجة.

لنبدأ الآن. لصناعة ماصات تثبيت الجهد (patch clamp pipettes)، نستخدم شعيرات بوريك من شركة Sutter في شعيرات دموية نظيفة وخالية من الغبار، ونستخدم جهاز سحب الأقطاب الكهربائية الدقيقة بالتسخين Sutter P-97. ويعد "كتاب طبخ الماصات" (Pipette Cookbook) من شركة Sutter مرجعاً ممتازاً لتطوير برامج سحب مناسبة.

للبدء، ارفع غطاء الغبار الموجود على جهاز سحب الأنابيب الشعرية. ثم خذ أنبوباً شعرياً زجاجياً واحداً من العلبة. تأكد من إعادة وضع الغطاء لتقليل تراكم الغبار.

بعد ذلك، قم بتمرير الأنبوب الشعري بيد واحدة في الأخدود الموجود على أحد جانبي الفتيلة، ثم أحكم ربط المشبك قليلاً. في هذه المرحلة، يجب أن يكون المشبك محكماً بما يكفي لمنع سقوط الأنبوب، ولكن مرناً بما يكفي للسماح بتمريره داخل الأخدود. والآن، حرر مصد المعدن الزنبركي الموجود على الجانب نفسه.

بعد ذلك، أمسك بإبهامك وسبابتك الألسنة المعدنية المثبتة في الجزء السفلي من كلا الحاملين. حرر سدادة التوقف المعدنية الزنبركية الأخرى. اسحب الحاملين معًا إلى أقصى حد ممكن وثبتهما في مكانهما بيد واحدة.

بعد ذلك، مرر الأنبوب عبر مبيت السلك المتوهج إلى أخدود الحامل في الجانب الآخر. تجنب دفع الزجاج باتجاه السلك المتوهج. أحكم ربط المشابك على كلا الجانبين.

يجب أن تكون هذه الروابط محكمة بما يكفي لتثبيت الحوامل في مكانها، ولكن ليس لدرجة تؤدي إلى سحق الزجاج. الآن، أغلق غطاء الغبار واضغط على الزر الأخضر. يتم تشكيل ماصات الأقطاب ذات الرؤوس المدببة المستخدمة في تسجيلات تثبيت الرقعة (patch clamp) باستخدام برنامج سحب مكون من خمس خطوات، مع خفض درجة الحرارة والسرعة في كل خطوة، وتشكيل قطب صغير في الخطوة النهائية.

يعتمد هذا البرنامج على الحرارة والجاذبية. وتتشابه إجراءات صنع أقطاب كهربائية حادة إلى حد كبير، ولكن في هذه الحالة، نستخدم شعيرة زجاجية رفيعة من شركة Warner Instruments بقطر خارجي يبلغ 1 مليمتر وقطر داخلي يبلغ 0.78 مليمتر. كما نطبق برنامج سحب يستخدم محركاً بالإضافة إلى الحرارة والجاذبية عند الانتهاء من برامج السحب.

ارفع غطاء الغبار، وقم بفك كلا المشبكين ثم أخرج الماصة الجاهزة. بعد ذلك، ضع الماصات في صندوق عمل. يمكن صنع هذا الصندوق عن طريق لصق شريط من الرغوة (الفوم) على حامل صندوق رؤوس الماصات البلاستيكي، ثم قص ست إلى ثماني شقوق في الرغوة.

أدخل الماصّات في الشقوق. بمجرد امتلاء الصندوق بالماصّات المسحوبة، انتقل إلى خطوة الصقل بالنار لصقل الماصّات. قم بإعداد جهاز صهر دقيق مزود بفتيلة تسخين من البلاتين يتم التحكم فيها بواسطة دواسة قدم قبل البدء في عملية الصقل بالنار.

أولاً، قم بتغليف الماصة بشمع الأسنان لتقليل السعة الكهربائية وتحسين خصائص الضوضاء. وللقيام بذلك، احتفظ بكمية صغيرة من الشمع المنصهر في مكان قريب. طبق ضغط هواء على الجزء الخلفي من الماصة لمنع دخول الشمع إلى الطرف.

ثم اغمس الطرف لفترة وجيزة في الشمع السائل، ثم أخرجه. ضع الماصة في جهاز التلميع وقرّب الطرف لمسافة 50 microns تقريبًا من الفتيل.

ضع في اعتبارك أن الفتيل سيتمدد عند التسخين. قم بتطبيق نبضة حرارية قصيرة لمدة ثانية واحدة أو ثانيتين لإزالة الشمع من طرف الماصة وتسوية الزجاج. افحص أطراف الماصة تحت المجهر لتحديد قطر الفتحة ومدى نعومتها.

بالنسبة لتسجيلات تثبيت الرقعة القياسية، يجب أن تتراوح فتحات الطرف ما بين 1 إلى 3 ميكرون في القطر، مع التخلص من الأطراف الخشنة أو غير المستوية أو غير المنتظمة. ضع الماصة المكتملة في صندوق العمل، مع التأكد من إغلاق الغطاء لحماية الماصات من الغبار، وكرر العملية حتى يتم تحضير 10 مصاصات بنجاح. لقد شرحت لك للتو كيفية صنع مصاصات تثبيت الرقعة والأقطاب الكهربائية الحادة باستخدام جهاز سحب قابل للبرمجة.

يمكن استخدام الإجراء نفسه لصنع مجموعة متنوعة من الأدوات الزجاجية، بما في ذلك إبر الحقن للحصول على أفضل نتائج لتثبيت الرقعة (patch clamp). ومن المهم تذكر سحب ماصات جديدة خالية من الغبار في نفس يوم التجربة، وصقلها خلال ساعة واحدة من بدء التجربة. كما يجب التحقق من خلال الفحص من أن الماصات ملساء ومصقولة.

تأكد من مشاهدة الفيديو الآخر، الذي يوضح كيفية إجراء تسجيل تثبيت الرقعة (patch clamp recording) للقنوات الأيونية التي يتم التعبير عنها في بويضات opus. حسناً، هذا كل شيء. لقد أصبحت الآن خبيراً في استخدام الماصات، وحظاً موفقاً في تجاربك.