处理火炬松PtGen2 cDNA微阵列

本视频由佐治亚大学沃内尔森林与自然资源学院的研究人员制作。该培训视频旨在详细介绍如何处理我们的 LOB lolly pine pt、第二代 cDNA 微阵列，特别关注杂交前后微阵列的洗涤和操作步骤。总体而言，我们的实验方案遵循基因组研究所 Tiger 以及范德堡微阵列共享资源中心（VMSR）所制定的流程，我们的微阵列即在该中心制备。

我们发现，为了最大程度地保证信号质量的均匀性和低背景，需要对PT Gen二代进行更严格的处理。第一步是预清洗。由于我们的点样缓冲液含有很高的盐浓度，因此必须进行此预清洗步骤以去除盐分。

将载玻片放入显微镜载玻片架中，然后在已预热至43摄氏度的0.2% SDS溶液中剧烈浸入15至20次。载玻片在SDS溶液中洗涤后，用镊子小心取出，转移至含有预杂交缓冲液的科普兰德罐中。该缓冲液包含5×SSC、0.1% SDS和1% BSA，并同样在43摄氏度下加热。

将 Copeland 小瓶用石蜡膜封盖，置于 43 度的培养箱中孵育一小时。预杂交完成后，将载玻片转移至显微镜载片架中，依次浸入五次去离子水中，每次更换水后上下浸入 15 至 20 次。最后，将载玻片放入异丙醇中浸洗五到六次，然后在芯片 M mate 离心机中离心至干燥。

离心后，使用经过0.2微米滤膜过滤的压缩空气吹干载玻片。然后将同样用压缩空气清洁过的提升盖玻片覆盖在载玻片上，并使用小移液器吸头调整提升盖玻片至正确位置。

在放置好盖玻片后、但在加入杂交缓冲液之前，我们在杂交 chamber 两端的加湿孔中各加入 20 微升 100 毫摩尔的 dihi，三 atol。现在我们准备加入已重悬于杂交缓冲液中的目标 cDNAs。将移液枪枪头置于盖玻片与玻片的边缘处，缓慢加入溶液。

我们发现，利用毛细效应加载芯片可提供最佳的一致性，并显著减少任何非预期气泡的产生。在将目标材料加入芯片后，组装杂交室并用铝箔覆盖。随后将杂交室置于摇动水浴中过夜孵育，通常为14至16小时。

水浴锅温度设置为48度，摇床转速设置为50 rpm。需要注意的是，从加入杂交溶液开始，直至所有杂交后洗涤步骤，操作均需在弱光条件下进行，以防止光氧化。次日，将载玻片从杂交盒中取出，放入盛有预热至53度的洗涤液一的柯普兰德罐中。

将载玻片置于Copeland染色缸中约1分钟，直至托举器自动滑落，随后用镊子轻轻取出载玻片，并放入显微镜载玻片架中，准备进行洗涤步骤。接着，将载玻片在第二个盛有53摄氏度洗涤液一的容器中剧烈浸洗15至20次。然后用封口膜覆盖容器，并将其置于设定为53摄氏度、100转/分钟的培养箱空气摇床中。

经过10分钟孵育并使用洗涤液一清洗后，将载玻片在室温下的洗涤液二容器中剧烈浸入并抽出15至20次。该容器需用Parafilm封口膜覆盖，然后再次置于室温摇床上，孵育10分钟。最后，将载玻片从洗涤液二中取出，并在装有洗涤液三的容器中剧烈浸入并抽出15至20次。

随后将载玻片转移至第二个装有第三种洗涤液的容器中，容器表面覆盖有perfil，并再次置于摇床中振荡10分钟。最后一次洗涤完成后，我们将载玻片离心至完全干燥。具体操作为：将一个15 mL的Falcon管盖放入50 mL的离心管中，然后将芯片的条形码面朝下放入该离心管中。

随后将离心管置于摆桶式转子中，在室温下以1500 RPM的转速离心。离心结束后，将载玻片转移至另一组50毫升的锥形管中，这些锥形管已用铝箔包裹。随后用氮气吹扫管内空气，氮气需经0.22微米滤器过滤，加盖后用于运输或保存至扫描前。

我们使用 PerkinElmer ScanArray 5,000 收集扫描数据。通过 BioDiscovery 的成像软件套件对芯片图像进行网格化处理，并对原始扫描数据进行处理和初步数据分析。随后，使用 BRB Array Tools 对斑点信号强度数据进行标准化并开展统计分析，BRB Array Tools 是一种稳健且免费的微阵列统计分析软件包，可从美国国家癌症研究所网站下载。

其他统计分析和基因表达模式搜索通过基因表达模式与分析工具套件 Jeep PPAs 进行。这是另一款可免费使用的基于网络的分析软件包。感谢您观看我们关于如何处理lob lolly pine PT Gen two微阵列的视频。

以下人员负责本培训视频的内容与制作。