基于液滴条形码的成年哺乳动物组织单细胞转录组学

该方法有助于回答微生物学领域中的关键问题，例如了解损伤或疾病后数千个单细胞中基因表达的变化。该技术的主要优势在于，能够解析复杂组织中单个细胞的转录组，从而更深入地理解特定细胞群体内的功能动态。本实验方案的优势在于，提供了从原代组织中单细胞的分离，到数据集的分析与可视化的一整套完整方法。

尽管本方法始于皮肤和神经的单细胞悬液，但我们所描述的测序方法可适用于研究任何哺乳动物组织。演示该实验流程的将是来自我实验室的两位学员 Elodie Labit 和 Wisoo Shin。首先，通过切断小鼠背部后肢区域的皮肤，解剖经安乐死处理的小鼠的坐骨神经。

使用无菌手术刀片沿大腿长度方向做一切口。然后使用精细镊子和剪刀暴露并分离坐骨神经。为解剖背部皮肤，使用精细镊子和剪刀从一侧肩部到另一侧肩部、横跨臀部以及沿背部向下做切口。

用预冷的HBSS洗涤组织两次。在解剖显微镜下，去除不需要的结缔组织、脂肪沉积物或碎片。仅针对皮肤组织，使用无菌手术刀片将皮肤切成薄片。

为了获得皮肤真皮层，将皮肤切片置于含有dispase的HBSS中，于10厘米培养皿中37摄氏度孵育30至40分钟。用精细镊子剥离并分离表皮与真皮，随后弃去表皮。接着，对于皮肤和神经组织，使用一对无菌手术刀片将每个样本切成1至2毫米大小的组织块。

将组织块放入新解冻的、每毫升含两克的冷胶原酶IV溶液中，置于15毫升锥形管内。将每个样本在37摄氏度水浴中孵育30分钟，期间每10分钟轻轻振荡一次。30分钟后，使用P1000移液器将组织吹打20至30次，然后放回水浴中。

每30分钟重复吹打一次，直至溶液变浑浊，且组织块基本解离。仅针对皮肤样本，在孵育的最后1小时，向皮肤样本中加入终浓度为1毫克/毫升的DNA酶。由于某些细胞类型对机械应力的敏感性高于其他细胞，过度的解离操作可能导致细胞群体的组成发生偏倚。

充分解离对于获得高细胞得率以及准确反映组织组成至关重要。随后，将40微米滤膜置于50毫升锥形管上方，对每个组织样本过滤两次。用1% BSA/HBSS冲洗滤膜。

按照文稿中所述离心样品后，使用宽孔枪头将细胞沉淀重悬于含1% BSA的HBSS中，并置于冰上。加入活率染料有助于优化您的制备过程。您应确保至少有80%的细胞具有活性。

优化后，可省略此步骤及其他质量控制步骤，以加快解离过程，从而更好地保持RNA质量并减少细胞损失。为了使用FACS分离活细胞和健康细胞，首先准备15毫升窄底试管，每管加入8毫升冰上预冷的1% BSA/HBSS溶液用于样品收集。为确保液体表面与管内壁之间的界面保持湿润，并防止静电和表面张力，应在收集前将试管倒置。

流式细胞分选后，立即将细胞收集至15毫升离心管中，用1毫升含1% BSA的HBSS洗涤并冲洗管壁上的所有细胞。随后以260 ×g离心8分钟。弃去上清液后，将细胞沉淀重悬于含1% BSA的HBSS中，取33.8 µL加入新管，并将该管置于冰上保存。

此步骤需使用标准化试剂盒中的试剂完成。所有演示步骤均应按照制造商的说明进行操作。为准备 GEM 生成，将芯片放入芯片支架中，并根据制造商的方案在冰上配制细胞主混合液。

向含有 33.8 微升自悬浮液的离心管中加入 56.2 微升主混合液。准备芯片时，首先向不使用的孔中加入 50% 甘油。然后向第一孔加入 90 微升细胞主混合液，向第二孔加入 40 微升凝胶珠，向第三孔加入 270 微升分隔油。

用垫圈覆盖芯片。要加载芯片并在单细胞控制器中运行，请先弹出托盘。将芯片放入托盘中。

收回托盘，然后按下播放键。运行完成后，收集 100 µL 样本，置于 PCR 管中。将 PCR 管放入预设好的 PCR 仪中，并按照试剂盒说明进行扩增。

运行结束后，GEMs 将包含来自多聚腺苷酸化 mRNA 的全长带条形码 cDNA。将试管置于 -20 °C 过夜。随后进行文库构建、测序、比对和分析。

在按照文稿中所述完成样本测序与比对后，将数据存入公共数据库，例如 NCBI 的 GEO。为此，请先注册提交者账户。首先，下载元数据表格以完成 GEO 数据提交。

确保每个项目提交仅包含一个元数据表。将电子表格放入目录中。其次，将所有文库通过 cell-ranger count 脚本生成的原始数据文件添加到目录中。

第三个文件夹是经过处理的数据文件。将所有文库通过 cell-ranger count 脚本生成的已处理数据文件放入该目录中。使用 GEO 提交者的 FTP 服务器凭据，传输包含全部三个组件的目录。

运行 Cell Ranger 后，可使用高级生物信息学方法对分析就绪的基因条形码矩阵进行进一步处理。首先，使用 Seurat R 软件包进行预处理的数量质控，生成小提琴图和散点图，以可视化基因数量、唯一分子标识符数量以及线粒体基因百分比，从而识别细胞双联体和异常值。在选择主成分（PCs）时，采用肘部图法，排除主成分轴标准差曲线 plateau 区域之后的主成分。

聚类的分辨率也被进行了调整。较低的分辨率导致较少的细胞簇，每个簇可能代表一种明确的细胞类型。较高的分辨率则产生更高的细胞概率，代表细胞群体中的亚型或过渡状态。

采用低分辨率聚类设置进一步分析表达热图，以鉴定特定聚类中表达水平最高的基因。使用 Seurat 的特征图（feature plot）功能在 tSNE 图上可视化各个候选基因，从而判断是否存在代表特定细胞类型的聚类，例如巨噬细胞。聚类2和聚类4均表达CD68，即泛巨噬细胞标志物。

其他软件包也提供了质量控制工具，例如 Monocle（一种用于构建细胞轨迹的 R 软件包），可去除低质量细胞，并确保所有细胞中 mRNA 的分布呈对数正态分布，且位于设定的上下限范围内。随后，利用已知的谱系标志基因对单个细胞进行分类和计数，表达目标标志物的细胞被归类为细胞类型一。经鉴定，细胞类型一为成纤维细胞。

通过评估该细胞群体构建成纤维细胞的发育轨迹。在此步骤之后，应进行定量PCR、原位杂交以及免疫组织化学等其他方法，以验证基因表达结果的准确性。单细胞mRNA测序现已为多个研究领域的科研人员提供了有力工具，可用于探索细胞间的异质性，并鉴定在稳态过程中不同组织内的功能动态变化，以及这些特性在损伤后或疾病发生发展过程中的改变。