荧光显微镜筛选与高通量测序：鉴定参与细胞器完整性的基因的有用工具

本实验的目的是鉴定负责植物细胞器形态和功能完整性的基因。首先，将甲基磺酸乙酯作为化学诱变剂加入携带细胞器荧光标记的突变型种子中进行诱变处理。第二步，收集第一代诱变植株的单株种子，用于培育下一代突变体群体 M2 代株系。

接下来，使用共聚焦或荧光显微镜观察经诱变处理的Eliana种子，以鉴定其异常的器官表型。最后一步是获得第三代诱变植株，并确认突变表型的存在。最终，可利用新一代测序工具对隐性突变进行定位。

一旦确定了突变基因的位置，利用野生型基因进行转化应能恢复异常的细胞器表型。该方法有助于解答植物细胞器形态和功能完整性维持中的关键问题。亚砜胺类化合物处理 sta 突变体种子可诱导基因组中胞嘧啶发生碱基替换，导致胞嘧啶转变为胸腺嘧啶。

引入突变。EMS处理是本方案中的关键步骤，旨在确保M2代个体中获得理想的突变比例。首先，获取已通过基因工程改造、携带相关细胞器荧光标记的野生型哥伦比亚生态型拟南芥种子。

将0.8克或约40,000粒种子转移至一个50毫升的离心管中。然后加入25毫升蒸馏水和0.2%乙基甲烷磺酸。将混合物在突变摇床中低速孵育16小时。孵育结束后，吸去液体并弃入含有1摩尔氢氧化钠的烧杯中。

为灭活EMS，向含有种子的Falcon管中加入25毫升水。盖紧管盖，颠倒混匀5次以清洗种子。待所有种子沉降后，吸除上清液并弃入1摩尔氢氧化钠溶液瓶中。

最后一次洗涤后，重复此洗涤步骤最多10次，然后将种子置于最小量的水中。加入25毫升10%的次氯酸钠溶液进行种子灭菌，并剧烈振荡30秒。待种子沉降至容器底部后，倒去次氯酸钠溶液，再用25毫升无菌水冲洗。

移除无菌水后，加入25毫升70%乙醇。将试管振摇30秒，静置使种子沉降至管底。倒去乙醇，用25毫升无菌水冲洗。

用无菌水重复清洗两次。然后将种子倒入含有三毫米滤纸的塑料培养皿中。在4°C条件下孵育种子两天后，于超净工作台中让种子干燥。

将种子放置于直径150毫米的培养皿中，每皿约250至300粒种子，置于含fighter gel作为凝固剂的半量Magi和Scoog培养基上。将M1代种子在培养皿中培养两周，然后将幼苗移栽至土壤中，使其继续生长。

30 至 45 天后，植株将进入成熟阶段，此时成熟的渗漏现象可清晰观察到。在此阶段，从每株 M1 植株中收集 M2 代种子，以建立 1000 个独立的 M2 代株系。为了在共聚焦或荧光显微镜下观察幼苗，将每个 M2 代株系的 60 粒种子置于塑料培养皿中，在 1/2 浓度培养基上培养 7 至 10 天。

在含有 fighter gel 的 Moreish 和 scoog 培养基上，同时在同一培养皿中培养五株未经 EMS 处理的对照种子苗。待种子苗生长后，取 5 至 10 个 cos 引物，将 ABAC 密封面朝向显微镜载玻片上的 40 倍物镜，加盖盖玻片，在荧光显微镜下观察每株 olein 从皮层至中轴区域细胞器标记物的亚细胞分布是否发生改变。将阳性植株移栽至土壤中，并按上述方法继续培养种子苗，确认突变表型存在于 M3 代。

通过将含有目标细胞器荧光标记的野生型基因组进行至少三次回交，去除污染的背景突变，具体操作详见书面实验方案。开始定位前，使用cogen DN Easy Z植物微量提取试剂盒从M三代中提取约三微克基因组DNA，该样本代表纯合突变体Columbia的DNA。将提取的DNA送交进行Illumina基因组分析仪2×14测序。

下一步是将zago突变体Colombia与Landsberg erecta杂交，通过自花授粉产生后代，从而获得可能发生目标基因组合的单株。由此产生的后代将作为作图群体，其中包含引起突变的感兴趣基因。通过将该群体的基因组DNA与野生型植株的基因组DNA进行比较，即可在基因组中确定该突变的位置。

在F2代植株生长后，收集70至100株表现出异常表型的F2个体，以及相同数量的野生型表型F2植株，使用打孔器从每株植株上采集一片叶盘。叶盘应取自相同年龄的叶片。为确保DNA量相近，样品可单独或分组进行基因组DNA提取处理。

在此情况下，可对每个离心管收集五到十个样本，从而减少需要提取基因组 DNA 的离心管数量。使用 MasterPure 植物叶片 DNA 纯化试剂盒提取基因组 DNA。随后可使用 NanoDrop 对每个样本获得的基因组 DNA 进行定量。

然后，将每个样本的等量 DNA 混合，总量达到 300 纳克，保持突变型和野生型样本分开，以首先进行标记反应，加入 60 微升 2.5 × 随机引物溶液和 42 微升水。将 DNA 在高于 95 摄氏度的条件下变性 5 到 10 分钟后，将样本置于冰上冷却以使 DNA 变性。加入 15 微升 10 × dNTPs。

加入生物素-dCTP并补至三微升。Glen聚合酶。25摄氏度下孵育样品过夜。

第二天，加入15微升3摩尔的醋酸钠和400微升冰冷的100%乙醇。将混合样品在–80摄氏度孵育1小时，随后在20,500 ×g离心15分钟。第二次离心后，用500微升冰冷的75%乙醇洗涤沉淀。

将 DNA 沉淀在 37 摄氏度下干燥 10 分钟。用 100 µL 水重悬沉淀，并取 5 µL 在琼脂糖凝胶上检测产量和质量。将随机引物标记反应产物上样到 1% 琼脂糖凝胶，样品来自野生型 F2 植株混合样本和突变型 F2 植株混合样本。

最后一步，将95微升的野生型和突变型标记反应产物用于基因芯片拟南芥ATH1全基因组阵列杂交。擦除扫描后，所获得的相应CL点文件通过我们的软件进行分析。安装软件后，打开程序并将书面实验步骤中提供的Bioconductor字符串粘贴至软件中。

然后按回车键，这将从阵列、基因分型和图谱网站安装标准的 BIOCONDUCTOR 软件包。将文本中列出的文件下载并解压缩到桌面的一个新文件夹中。保留从基因芯片实验中获得的野生型 C、L 和突变型 C 的数据。现在将野生型 C 和突变型 C 的基因芯片数据复制到该文件夹中。

接下来，打开适用于 PC 的 R。点击“文件”，然后点击“更改目录”。选择包含文件的文件夹，点击“文件加载工作空间”，然后选择 A one V five R 数据，使用记事本打开 read C do R，并将全部文本复制到 R 中。对于 Mac，点击“mis”，然后点击“更改工作目录”。

选择包含文件的文件夹。单击工作区，加载工作区文件，然后选择 ATH one V five R 数据。类似地，使用文本编辑器打开 SFP R 和 MAP R，复制文本内容，并将其粘贴到 R 的控制台窗口中。

将出现一条消息，提示在拟南芥信息资源库（Arabidopsis information resource）或TAIR中搜索基因。请将文本中找到的链接复制并粘贴到互联网浏览器中。随后将弹出一个窗口，提示打开或保存文件。

选择保存。输入文件名并添加扩展名。执行 x ls 操作。

然后点击保存。此处显示的是预期的典型结果。在分析基因芯片拟南芥H1基因组芯片获得的数据后，该图展示了利用基因芯片拟南芥H1基因组杂交进行哥伦比亚0突变定位的一个示例，其中水平条形表示检测的阈值。

本示例中的突变位于第一条染色体上，由垂直条线标示其范围。打开文件 dot XLS，以查找该突变体在定位区域内的坐标。在该突变体基因组的Illumina测序读段组装结果中，从单核苷酸多态性中鉴定出特定的EMS转换突变。

一旦掌握，本方案所述方法可在较短的时间内用于基因定位，相较于传统定位方法具有显著的时间优势。