用于图案化生物分子的微电极上防污自组装单分子层

该实验首先在硅胶基底上制备微电极。在微电极及基底表面形成聚乙二醇自组装单分子层，以防止微管发生污染。随后制备罗丹明标记的微管。

最后，利用电泳技术将微管图案化至修饰电极上。大家好，我是来自德克萨斯农工大学物理系纳米实验室以及生物医学工程系分子生物力学实验室的 John Noel。我是来自物理系、同时也是德克萨斯农工大学中心技能科学与技术中心主任的 Wil free Teza。

我是胡安·邝（Juan Quang），德克萨斯农工大学生物医学工程系分子生物力学实验室主任。今天我们将向您展示一种制备涂覆有抗污染自组装单分子层的微电极的实验方法。在我们的实验室中，该方法用于通过电泳技术研究微管解聚。

那么，让我们开始吧。首先，使用刻划笔或晶圆切割器将硅片切割成1厘米×1.5厘米的片状，用作基底。接着，将基底放入盛有足量丙酮的烧杯中，确保丙酮完全覆盖基底，然后进行超声处理5分钟，在此过程中避免基底干燥。

用新鲜的丙酮冲洗，然后立即用异丙醇再次冲洗，并用氮气吹干。采用标准的正性光刻或电子束光刻技术，在洁净的基底上制备金微电极。设计图案几何形状时，应使每个电极图案的直径小于100微米。为确保聚乙二醇三甲氧基硅烷自组装单分子层（PEG SAM）能够完全覆盖，需在距离图案300至500微米处设置接触焊盘，并用一条1毫米宽的导线将焊盘与电极连接。

在抗蚀层中形成图案后，使用镊子从电极焊盘向衬底边缘在抗蚀层上划出一条线。金属沉积后，该划痕将实现电极与衬底边缘之间的电接触。采用沉积腔室（最好配备两个源）来沉积金属层。

通过先沉积两纳米的铬，再沉积六纳米的金来形成电极。在不破坏真空的条件下，可使用腔室内配备的石英晶体微天平在沉积过程中实时测量薄膜厚度。现在我们可在通风良好的区域开始制备自组装单分子层，将烘箱预热至75摄氏度。在250毫升玻璃烧杯中，加入一毫升聚乙二醇硅烷至20毫升甲苯中，配制硅烷化溶液。

用移液器上下吹打5到10次充分混匀，然后用移液器搅拌30秒。将图案样品有图案的一面朝上放入烧杯中，确保样品完全浸没在溶液中，并在烧杯底部均匀分布。将烧杯放入烘箱中，在SAM形成期间加热烘烤18至21小时。

通过在22 mm × 50 mm的玻璃盖玻片上先沉积1纳米铬，再沉积4纳米金，制备对电极。对电极应近乎透明，呈浅灰色或粉红色。将镀层面朝上存放于培养皿中，以保持清洁。

在烘箱中放置18至21小时后，将烧杯从烘箱中取出。甲苯应已蒸发，留下图案样品在黏稠的peg cline残留物中。向烧杯中加入20毫升甲苯，浸泡样品1至2分钟。

将样品从烧杯中取出，依次用甲苯、异丙醇冲洗，最后用氮气吹干。此时，样品应看起来洁净，自组装单分子膜（SAM）层在肉眼观察下应不可见。以此方法制备的SAM样品在低温干燥条件下储存可使用长达两天。

若SAM形成不成功，则会在表面形成浑浊或颜色不均匀的残留物涂层。在制备好SAM后，我们现在可以开始微管蛋白的聚合反应以形成微管。首先将未标记的微管蛋白和r domine标记的微管蛋白解冻，并立即按2:1的比例（未标记∶标记）混合，以获得明亮的微管。

用移液器上下吹打数次，充分混匀。接下来，将微管蛋白在37摄氏度的水浴中温育20至40分钟以诱导其聚合。在微管蛋白聚合的同时，通过将20微摩尔的紫杉醇与PEM缓冲液混合，配制含紫杉醇的PEM缓冲液。

通过反复吹打并涡旋充分混匀，然后将离心管置于37摄氏度的水浴中。聚合完成后，用预热的含紫杉醇缓冲液稀释微管，并避光保存。通过数分钟的荧光激发，验证微管聚合是否成功，并确认微管保持稳定。

通过成像已制备的微管，同时使用氧气清除混合物使微管蛋白完全聚合为微管。接下来开始利用电泳对微管阵列（MTS）进行图案化。首先，将双面胶带贴在玻璃载片上，用剃刀刀片将其切成细条，然后将两条双面胶带条横向贴在经图案化处理的自组装单分子膜（SAM）包被的样品上，使电极位于两条胶带之间，且连接路径与胶带方向垂直。

将对电极放置在双面胶带上，使金属面与胶带接触，且样品边缘超出对电极约三毫米。剪取数段15厘米长的绝缘铜漆包线，并将两端各剥除1厘米的绝缘层。使用少量银浆将导线连接至基底暴露的金区域，注意避免与对电极形成电接触。

现在使用银漆将第二根导线连接到对电极上。用银漆固定的电极导线可用胶带进一步固定在样品上。接下来，使用移液器加入适当稀释的微管溶液，在20倍放大倍数下观察并定位硅片上的图案，然后施加电压。

由于流动室的深度较大，可能需要使用长工作距离物镜来观察流动室的上表面。样品表面到流动室上表面的距离由胶带的厚度决定，通常约为 60 至 100 微米。施加最高一伏的电压，并观察微管的迁移情况。

如果需要可逆地捕获微管，请使用指甲油密封流动室以防止横向漂移，并使用较低的电压，低至约 0.5 伏。通过调节显微镜的焦平面，可在施加约 0.9 至 1.2 伏电压时观察到微管在电极表面的定位，从而追踪其迁移过程。

较高的电压会使迁移更快，黏附更牢固，但过高的电压会引发电解并导致解聚。微管：我们刚刚向您展示了如何制备经自组装单分子层（SAM）包被的微电极，用于微管的图案化，因为SAM涂层可防止微管在微电极上的吸附。该方法也可用于微管的可逆图案化。

此外，该过程不仅限于微管，还可用于对生物分子进行普遍的图案化。就此结束。感谢观看，祝您的实验顺利成功。