创建用于蛋白质和细胞限制的二维图案化基底

以下实验的总体目标是开发一种二维图案化基底，用于调控蛋白质吸附和细胞生长。该目标通过光刻技术制备具有图案的母版来实现，该母版用于制作微接触印刷用的A-P-D-M-S印章。第二步是制备图案化金基底，该过程涉及微接触印刷，以形成能够吸附蛋白和抵抗蛋白吸附的区域图案。

接下来将蛋白质和细胞添加到基底上，以观察图案并进行研究。通过荧光显微镜和相差显微镜获得的细胞生长和行为结果表明，这些图案化基底能够有效限制蛋白质和细胞在预定区域内的分布。该技术相较于其他现有方法（如蛋白质微接触印刷）的主要优势在于，末端为乙二醇的单分子层能够抑制非特异性蛋白质和细胞在图案背景区域的吸附。

通常，初次使用该方法的研究人员会遇到困难，因为必须针对每种打印图案优化合适的压印技术。开始制备图案化主模板时，将硅片置于匀胶机上，在双循环旋涂程序的第一步，用丙酮冲洗硅片。在旋涂程序的第二步，丙酮将挥发，从而在旋涂开始时留下洁净干燥的硅片，随后将光刻胶涂覆于硅片表面，并按照前述条件进行旋涂。

使用高均匀性加热板在 110 摄氏度下对涂有光刻胶的晶圆进行软烘 2 分钟。下一步光刻图形化。使用掩模对准系统和适当的掩模对涂有光刻胶的晶圆进行光刻。

首先，将基底放置到光刻对准仪的真空吸盘上。然后将掩模插入夹具托盘中，并打开真空以固定掩模，确保掩模与基底之间接触良好。升起基底，直至其与掩模接触。

利用对准器的光学系统确认已实现良好接触。最后，打开光源，使基底通过光刻掩模暴露于紫外光下。将图案化的晶圆放入显影液中，在轻柔搅拌条件下显影1分45秒。

用半导体级去离子水彻底冲洗，并用氮气流吹干，然后使用带紫外滤光片的显微镜检查图案的形成情况。首先按重量比10:1配制树脂与固化剂的混合物，充分混合Cigar 180 2。

将混合物覆盖在一次性培养皿中的光刻图案晶圆上，置于真空干燥器中脱气，直至PDMS覆盖的模具中无可见气泡。确保模具位于培养皿底部后，将印章置于65摄氏度的烘箱中固化1.5小时。PDMS印章固化完成后，从模具上取下印章，并修剪至合适尺寸。

将印章存放在有盖容器中，功能面朝上，以防止灰尘和碎屑污染。在准备用于金属沉积的基底时，首先将圆形玻璃盖玻片用氧气等离子体处理10分钟。然后用去离子水冲洗盖玻片两次，每次冲洗之间用氮气流吹干；用水冲洗后，再用乙醇冲洗两次，每次冲洗之间同样用氮气流吹干。

使用多源电子束沉积系统，先沉积50埃的钛，然后沉积150埃的金。在沉积钛层和金层之间不要对蒸发室进行放气。用乙醇冲洗PDMS印章，并彻底干燥。

用氮气将点样溶液逐滴施加至印章上，直至完全覆盖。用氮气彻底干燥印章。六甲烷烷的微接触印刷效果取决于PDMS印章的结构特征，是该实验过程中最具挑战性的环节之一。

成功的印章转印需要掌握一种施加均匀压力的良好技术。在转印过程中，对于在空气中进行的传统微接触印刷，应轻轻将印章按压到金基底上，并让单分子层形成15秒。

或者，对于由极小特征和高宽比结构组成的图案，将金基底放入含有18.2兆欧·厘米去离子水的培养皿中，确保基底完全浸没。然后轻轻将印章压在金基底上，静置15秒以形成单分子层。接着，用乙醇冲洗 stamped 基底两次，并用氮气吹干。

每次冲洗后，将基质放入培养皿中，并用底物填充液覆盖基质。用封口膜密封培养皿以防止蒸发。在避光条件下静置12至14小时，使背景单层膜形成。

最后，从背面填充溶液中取出带有图案的盖玻片，每次用乙醇冲洗后均用氮气干燥，共冲洗两次。将蛋白质施加到带有图案的盖玻片上时，可将盖玻片放入小型培养皿或细胞培养腔室中，并加入500微升至1毫升的脱钙磷酸盐缓冲液（DPBS）。在蛋白质孵育过程中，DPBS必须完全覆盖基底。

为确保蛋白质覆盖均匀，将蛋白质浓缩液加入DPBS中，并通过反复吹打混匀溶液。将蛋白质混合物与底物在37°C下孵育1小时。孵育结束后，用DPBS彻底冲洗底物以去除未结合的蛋白质，注意避免底物干燥或使其穿过气液界面。

经过三次洗涤后，吸除 DPBS。然后加入约 500 微升完全细胞培养基，以维持基质湿润。更换用于洗涤基质的培养基。

加入新鲜培养基后，基底即可用于细胞接种。通常每平方毫米接种30至200个细胞。此图像显示了A-P-D-M-S印章在显微镜下的形态，将印章的图案面朝下放置在玻璃盖玻片上进行观察，比例尺为100微米。

正确的压印可产生清晰锐利的蛋白质图案，可通过应用荧光标记蛋白（如LOR 6 47标记的纤连蛋白）进行可视化观察。图中显示了chk one细胞被限制在蛋白质图案上的情况。这些图像中的比例尺为100微米。

此外，可采用免疫组织化学方法在SU固定后观察蛋白质的图案。此处使用LOR三50偶联的抗层粘连蛋白抗体，对图案化层粘连蛋白上接种的E18小鼠海马神经元进行染色，图中显示的是体外培养四天的结果。E18小鼠海马神经元经MIT tracker red五80染色后显示，细胞生长被很好地限制在蛋白质图案区域内。尽管该技术易于掌握，但在图案化基底制备过程中仍可能出现一些常见问题，如通过LOR六47偶联的纤连蛋白吸附所观察到的结果所示。

在DPBS中，若未充分混匀浓缩的蛋白溶液即进行蛋白涂布，可能导致蛋白图案不均匀。印章转移操作不当可能导致部分图案转移失败或印章塌陷。此外，将含有吸附蛋白的图案基底暴露于空气中，可能会破坏单分子层，导致电阻降低。

在背景中，浸没式图案化技术能够制备出具有微小特征的图案，而这些微小结构通过传统的微接触印刷和空气环境印刷难以实现。这两幅图像展示了使用同一块PDMS印章在空气或去离子水中印刷的同一图案的不同区域；左侧图像中显示了支撑线，以说明仅有图案中的微小特征未能成功印刷。比例尺为20微米。一旦掌握该技术，若操作得当，可在18至24小时内完成。

观看本视频后，您应能够充分理解如何制备图案化基底，制备 A-P-D-M-S 印模，利用微接触印刷技术制备图案化金基底，并通过蛋白质和细胞对图案进行可视化观察。