一种通过玻璃表面功能化实现靶向细胞分离的方法

该玻璃表面功能化过程的总体目标是实现对目标细胞的温和捕获与释放。该方法有助于解答肿瘤血管生成领域的关键问题，能够筛选出指示药物耐药性的细胞生物标志物。该技术的主要优势在于其完全可定制化，几乎适用于任何目标细胞类型。

只要存在针对该细胞类型的特异性抗体，即可对表面进行改造以实现其捕获。尽管该方法可为癌症血管生成研究提供见解，但由于其他疾病的个性化治疗方案开发同样需要纯化的样本，因此该方法也可应用于其他疾病。我们最初产生该方法的设想，是在尝试利用脱硫生物素与亲和素家族之间的相互作用，开发一种可逆释放机制以捕获细胞时提出的。

根据文本方案，将玻璃表面在氧气等离子体仪中清洗5分钟后，取50微升APTES和2.45毫升乙醇加入锥形管中，配制2.5毫升2%的重组3-氨基丙基三乙氧基硅烷（APTES）溶液。用移液器将APTES溶液滴加到玻璃表面，覆盖后置于室温下的摇床上震荡50分钟，以均匀分布APTES层。在此期间，将烘箱预热至55摄氏度（用于8孔和24孔板）或90摄氏度（用于玻璃培养皿）。

从摇床取出培养板后，按照文本方案使用乙醇冲洗玻璃表面。用100%氮气吹干表面。然后将八孔和24孔板放入烘箱中烘烤两小时，或将玻璃培养皿放入烘箱中烘烤一小时。

接下来，通过将1.5毫克/毫升的d-脱硫生物素（d-Desthiobiotin，DSB）溶于37.5微升二甲基亚砜（DMSO）中，并将5毫克/毫升的EDC加入2,462.5微升0.1摩尔MES缓冲液（pH 6）中，配制共2.5毫升的DSB溶液。然后将两种溶液混合。反应15分钟后，加入1微升β-巯基乙醇（BME）以终止DSB与EDC之间的反应。

将热的APTES功能化玻璃表面从烘箱中取出，静置冷却5到10分钟。加入MES缓冲液冲洗玻璃表面，移液时保持移液器与表面呈70度角，使枪头不直接对准表面。然后从固定位置（如孔的角落）反复排液和吸液，以完成缓冲液的冲洗。

然后，用 MES 缓冲液再冲洗两次。将 DSB 溶液涂于玻璃表面，转移到培养皿内湿润的纸巾上，盖上培养皿，并在冰箱中孵育 18 至 24 小时。

在4摄氏度孵育后，用PBS冲洗每块玻璃表面三次，操作方式如本视频前面所示。然后，将链霉亲和素（Streptavidin）或SAV储存液稀释至0.4毫克/毫升，并均匀地涂布于玻璃表面，形成一层薄层。玻璃孵育18至24小时后，用150微升PBS对每个表面冲洗三次。

然后用去离子水浸湿一张纸巾，将其平铺于直径14厘米的培养皿中，环绕在孔板周围，以保持孔内湿度。用玻璃表面盖上培养皿，并将其置于4°C的生物安全一级冰箱中，直至需要时使用。进行细胞捕获时，从T175细胞培养瓶中吸除培养基。

然后用 PBS 清洗细胞，并吸去缓冲液。向培养瓶中加入 10 毫升非酶解解离试剂，例如细胞解离溶液。随后在 37 摄氏度孵育 6 分钟。

六分钟后，加入 10 毫升冷的 HBSS 以稀释消化液。然后用移液器取 20 微升细胞悬液，使用血细胞计数板进行细胞计数。将细胞悬液在 4°C 下以 500 × g 离心 5 分钟。

用HBSS重悬细胞，使细胞浓度为每毫升1×10⁶个细胞。通过反复吹打使细胞充分悬浮于溶液中，以减少细胞团块形成，避免影响抗体结合。随后，将细胞悬液分装为对照组和实验组两份独立的溶液。

将生物素标记的抗体加入相应的细胞溶液中，在4°C条件下于翻转混合仪上孵育30分钟。使用150 µL HBSS在八孔板中对功能化玻璃片进行洗涤，如视频前面所示，共洗涤三次。将细胞溶液加入孔中，并在冰上于摇床中孵育45分钟。

在此期间，用无菌 HBSS 配制 20 毫摩尔的生物素溶液。随后，在孵育结束后，轻轻用 150 微升 HBSS 将细胞溶液从玻璃表面冲洗下来。重复冲洗步骤两次后，向各个释放孔中分别加入 150 微升生物素溶液，并孵育 20 分钟，以使反应充分进行。

使用HBSS洗涤细胞，回收非特异性结合的细胞。然后根据文本方案进行荧光成像和分析。将培养瓶中活细胞的图像作为对照包括在内。

在本实验中，将 MCF7GFP 细胞暴露于功能化表面。使用 HLA-ABC 抗体捕获了 60% 的细胞。当暴露于 20 毫摩尔生物素时，80% 被捕获的细胞被释放。

如图所示，当将 MCF7GFP 细胞与 RAW 264.7 细胞混合时，50% 的 RAW 巨噬细胞被捕获，随后加入 20 µM 生物素，可释放出 80% 被捕获的 RAW 细胞。该结果表明，作为阳性对照的 RAW 巨噬细胞无荧光活性，而作为阴性对照的 MCF7GFP 细胞则显示 GFP 荧光阳性。

由于过量的抗体可能降低细胞捕获效率，因此通过将HLA抗体浓度从0至每毫升10,000纳克进行梯度滴定，对抗体浓度进行了优化。结果显示，理想的抗体浓度范围为每毫升100至1,000纳克。此外，细胞优化实验确定，可有效捕获的细胞理想浓度范围为每毫升1×10⁵至1×10⁶个细胞，因为低于该数量的细胞浓度将低于背景值。

掌握该技术后，可在三天内完成实验，实验操作时间少于六小时（不包括过夜孵育时间）。在进行该实验过程中，重要的是要记得收集细胞洗涤液，因为这些洗涤液可提供有关表面有效性的关键信息。在完成该实验步骤后，还可采用其他方法（如流式细胞术）来回答更多问题，例如目标细胞可能具有的受体表达水平。

表面功能化技术发展之后，为生物材料领域的研究人员探索材料与生物体的安全整合开辟了道路，例如将植入物用于多种疾病和损伤的治疗。观看本视频后，您应能够充分理解如何对玻璃表面进行表面功能化，以捕获并释放目标细胞，从而实现后续分析。请务必注意，使用叠氮化钠处理活细胞时可能具有极高危险性，因此在操作过程中必须采取适当培训、个人防护装备（PPE）以及规范废弃物处置等安全预防措施。