使用 NanoDrop 2000c 分光光度计进行微量蛋白质浓度测定
2009年11月4日
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采用利用自然表面张力保留样品而无需使用比色皿或毛细管的分光光度计系统，可对微量样品进行定量。该方法显著提高了蛋白质浓度的检测动态范围及检测速度。
概述
NanoDrop 2000 C 分光光度计采用创新技术，无需使用传统的比色皿即可测量蛋白质和核酸的微量样品。该方法提高了测量速度和动态范围，能够高效地测定蛋白质浓度。
关键研究组成部分
科学领域
- 生物化学
- 分析化学
- 蛋白质分析
背景
- NanoDrop 技术利用光纤和表面张力来保留样品。
- 可直接测量微量样品体积（1-2 µL）。
- 无需比色皿，减少了样品需求量和清洗时间。
- 该系统可在无需稀释的情况下测量高浓度样品。
研究目的
- 演示使用 NanoDrop 2000 C 测定蛋白质浓度的操作步骤。
- 突出微体积分光光度法的优势。
- 提供有效使用该设备的指导规范。
使用的方法
- 将样品直接移液至光学基座上。
- 使用适当缓冲液作为空白对照进行校准。
- 在280 nm处测量吸光度以确定蛋白质浓度。
- 对未表征的蛋白质采用比色法检测，如BCA法。
主要结果
- NanoDrop 2000 C 可提供快速且准确的蛋白质浓度测定。
- 表面张力可有效固定微体积样品以进行分析。
- 实时光程长度调节可提高测量准确性。
- 测量之间所需的样品清洗步骤极少。
结论
- NanoDrop 2000 C 是科研领域中用于蛋白质分析的重要工具。
- 其设计简化了测量流程，并减少了样品消耗。
- 比色法拓展了其在多种蛋白质样品中的应用范围。
常见问题
使用 NanoDrop 2000 C 的主要优势是什么？
其主要优势在于能够无需比色皿直接测量微量样品，从而实现更快、更高效的蛋白质浓度测定。
测量需要多少样品？
测量仅需1-2微升样品。
NanoDrop 2000 C 能否测量高浓度样品？
是的，由于其可调节的光程长度，该仪器能够测量高浓度样品而无需稀释。
可以分析哪些类型的样本？
它可以分析蛋白质和核酸，特别是那些含有在280 nm处有吸收的特定残基的分子。
光学基座推荐使用何种清洁方法？
建议使用干燥的实验室擦拭纸在测量之间清洁光学表面。
使用 NanoDrop 时有哪些溶剂不应使用？
是的，不应使用氢氟酸溶液和含有表面活性剂的试剂，因为它们可能会影响测量表面。
行业重要性概述
微量蛋白质定量解决了早期发现阶段样品量有限的难题，能够在使用最少材料的情况下实现精确的靶点验证。NanoDrop 2000c 无需稀释即可提供快速、可重复的浓度数据，从而提高预测可信度，支持先导化合物筛选中的决策判断。其实时光程自动调节功能和宽广的动态范围，有助于在发现阶段的各类工作流程中提升检测方法的标准化水平。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 科学价值：利用 A280 吸光度检测纯化的蛋白质样品，可快速评估蛋白表达量和纯度。
- 操作价值：将样品消耗量减少至 1–2 µL，保留珍贵样品用于后续分析。
- 预测价值：通过为活性和结合研究提供准确的浓度输入，支持功能靶点的验证。
筛选与检测方法开发
- 科学价值：通过精确的定量，促进生化和基于细胞的检测中标准化蛋白质样品的制备。
- 操作价值：无需使用比色皿和稀释步骤，加快检测设置过程，并提高实验的可重复性。
- 可扩展性：通过快速测量及样品间简单的擦拭清洁流程，实现高通量检测的准备。
转化与临床前研究
- 转化连续性：通过在基于BCA的检测中实现蛋白质标准品和样品的定量，支持生物标志物的比对。
- 临床前模型相关性：通过为裂解液和提取物提供可靠的浓度数据，确保功能研究中的准确给药。
- 基于风险调整的推进：通过精确的蛋白质归一化，降低靶点结合研究中机制上的不确定性。
流程与工作流整合
NanoDrop 2000c 贯穿从早期靶点验证到先导化合物鉴定，再到临床前评估的整个发现过程，支持各阶段间一致的蛋白质定量分析。
- Discovery Biology：通过在通路和相互作用研究中实现蛋白质样品的精确归一化，支持假设验证。
- Screening：提供即用型、可重复的蛋白质输入，适用于酶学、结合及功能筛选实验。
- Analytics：提供定量的A280和比色检测结果，支持不同条件和样品间的比较分析。
- Translational Research：通过BCA分析中标准曲线和样品分析的可靠定量，将基础发现与临床前研究相连接。
- Enterprise Reuse：作为可在多个项目和团队间共享复用的平台，用于蛋白质定量。
运营与企业影响
- 科学价值：通过减少蛋白投入量定量中的变异性，提高靶点验证的预测可信度。
- 操作价值：通过自动路径长度校正和最小化样品操作，增强实验的标准化与可重复性。
- 战略价值：通过最大限度减少样品浪费并加快检测时间进程，提升资本使用效率。
- 项目组合影响：提供可靠的浓度数据，支持在先导化合物优化中进行风险调整后的“推进/终止”决策，实现优先级排序。
实施注意事项
- 需要具备移液和微体积技术样品处理方面的基本实验操作培训。
- 需配备 NanoDrop 2000c 分光光度计及适用于表面维护的配套实验室擦拭纸。
- 为获得准确结果，需在团队间统一校准程序和缓冲液匹配方案。
- 对于可能影响表面张力依赖性液柱形成的黏稠或含表面活性剂的样品，需考虑方法适应性调整。
- 存在实际应用限制，例如不能使用氢氟酸以及富含表面活性剂的试剂，因其可能随时间推移导致光学表面降解。
生物制药常见问题
为什么A280吸光度测定对靶点验证很重要？
A280 吸光度可实现对含有色氨酸、酪氨酸或半胱氨酸残基的纯化蛋白质进行快速、免标记的定量，为早期靶点验证工作流程中评估表达水平和纯度提供关键依据。
微量采样如何融入蛋白质发现流程？
使用1-2 µL样品进行微量取样可保存表达系统或纯化过程中有限的材料，从而在不消耗下游功能或结构分析所需样品的情况下实现定量检测。
实时光程长度调整在蛋白质定量中具有什么作用？
实时光程长度调节技术使 NanoDrop 2000c 能够在无需稀释的情况下测定高浓度蛋白质样品，从而扩展了动态范围，并确保对多种样品类型均获得准确的读数。
为什么复制要求对于跨职能协作至关重要？
重复性要求可确保不同用户和实验室之间蛋白质浓度数据的一致性和可重复性，从而支持在靶点验证和检测方法开发中对结果进行可靠比较。
在实施BCA法蛋白定量之前需要进行哪些统计分析？
实施BCA法定量需要利用参考标准品绘制标准曲线，以准确插值未知样品的浓度，这是对裂解液或提取物中蛋白质进行可靠测定的前提条件。
