使用可调电阻脉冲传感技术对外泌体囊泡进行定量和粒径分析

以下实验的总体目标是利用可调电阻脉冲感应技术对外泌体进行定量和粒径分析。常规方法是将纯化的外泌体所测得的电流阻断信号与聚苯乙烯微球标准品的信号进行比较。另一种表征外泌体的方法是在样品中加入聚苯乙烯微球作为内标，该方法适用于处理如未纯化外泌体等复杂样品的情况。

在细胞培养基中，所获得的数据可表征细胞外囊泡的大小和数量，无论其是否经过纯化。与现有的其他方法（如蛋白质印迹或结合于乳胶微球上的细胞外囊泡的流式细胞术）相比，该技术的主要优势在于无需物理分离或标记，即可直接对生物液体中的颗粒进行表征。通常，初学者会遇到困难，因为细胞外囊泡在大小上具有异质性。

在尝试检测较小囊泡时，较大的囊泡可能会堵塞纳米孔。我们已在实验方案中添加了一些实用的技巧和方法，以快速恢复至可操作的状态。我们试图减少细胞外囊泡的产生，并需要一种方法来定量测定细胞培养上清液中囊泡的浓度。

在寻找表征纳米颗粒的方法时，我们发现了TRPS技术，并对其操作流程进行了改进，使其更适用于外泌体、细胞培养上清液及其他生物液体的表征。首先，将TRPS仪器连接至安装有Exoid控制套件软件的计算机。务必尽量减少电干扰，具体措施详见文本操作流程。

现在选择纳米孔的尺寸。对于直径为70至200纳米的囊泡，NP 100是最佳选择；而对于直径为85至300纳米的囊泡，可使用NP 150。NP 200则更适合测量直径为100至400纳米的囊泡。

然后为 NP 100 和 NP 150 选择相应的聚苯乙烯校准颗粒，为 NP 200 选择 CPC 100 校准颗粒。使用 CPC 200 校准颗粒。将校准颗粒涡旋振荡 30 秒。

如果仍存在聚集现象，则使用超声处理，然后将校准颗粒用 PBS 稀释至目标浓度。根据纳米孔的尺寸，最终体积必须至少为 40 微升。现在用 78 微升 PBS 润湿仪器的下部液池，随后立即吸除。

这可以降低纳米孔下方产生气泡的风险。接下来，将纳米孔放入仪器的两个对向臂中。使用数显卡尺测量两个对向臂之间的距离。

将该数值输入软件中名为“stretch”的字段，输入后，使用控制相对臂之间距离的侧轮，点击“calibrate stretch”。将纳米孔拉伸至47毫米。拉伸至指定尺寸后，向下方流体池重新加入78微升PBS。

开始校准过程，将上部液池放置在纳米孔上，并安装屏蔽罩。然后向上部液池中加入 40 微升稀释后的校准颗粒。接着施加至少 0.8 千帕的正压。

使用可变压力模块（VPM），选择正电压并点击开启。然后在分析阻断信号的同时缓慢降低拉伸程度。这些信号由校准颗粒引起。

随着拉伸程度的降低，阻断高度将逐渐增加，从而提高信噪比。增加电压也可以提高阻断高度，但同时可能产生更多的均方根噪声。当观察到的阻断信号明显超过背景水平时，应停止减小拉伸，具体可从信号轨迹面板中观察到。

其次，观察颗粒速率。然而，此项的阈值较为宽松。理想情况下，颗粒速率应至少达到每分钟100个。

然而，如果每分钟粒子数超过2000，则需稀释样本并重新校准仪器。如此高的粒子数可能导致本演示实验的测量结果不准确。对先前纯化的脑肿瘤细胞系来源的细胞外囊泡进行表征。

首先将校准颗粒加载到上部流体池压具中。开启后，使用VPM施加压力，并在此记录至少500个颗粒的数据。施加的压力为0.8千帕。

可选择进行多压力测量来完成此步骤：增加施加的压力，并记录第二个校准文件。压力增量至少应为 0.2 千帕。现在将样品从上部腔室中取出，用 PBS 每次 100 微升，清洗腔室三次。清洗后，用无绒纸擦干上部流体腔室。

接下来加入实验样品。基线电流必须在测量校准颗粒时所观察到的电流的3%范围内。如果不在该范围内，可轻敲或旋转屏蔽帽，推入活塞，或完全取出纳米孔并用去离子水冲洗。

如果观测到的电流良好，则施加与校准颗粒所用完全相同的压力。然后记录至少500个颗粒，并保存数据文件。如果颗粒检测突然中断、基线电流下降或均方根（RMS）噪声突然增加，则暂停记录，并尝试疏通纳米孔。

与之前相同，用移液器将样品上下吹打。轻敲或旋转屏蔽帽，推动柱塞，或完全取出纳米孔，并用去离子水冲洗。另一种策略是将纳米孔拉伸至最多 47 毫米，并在约五分钟内将 VPM 的压力调至最大。

由于这也可能在软件中取消插拔NPO。转到“分析数据”选项卡，通过右键单击未处理文件选项并选择处理文件选项，开始处理数据。然后，为了将样品文件与校准文件配对，请单击样品旁边的复选框。

在校准列中，选择相应的文件并确认。软件将显示不同的样品特征，如尺寸、分布、基线持续时间、半峰全宽以及浓度分析结果。

以下方法适用于在制备过程中使用标准方法易导致严重堵塞的样本，例如生物液体。将至少50微升的细胞培养物在300 ×g 条件下离心7分钟，收集含有细胞外囊泡的上清液。同时，对样本和对照组均以相同方式制备单独的培养基对照。将20微升上清液转移至新的离心管中，加入20微升PBS和10微升稀释后的335纳米聚苯乙烯微球储备液（浓度为每毫升1000万个微球）。

现在按照之前的方法设置仪器，使用 NP 200 纳米孔，并测量仅含微珠的培养基对照样品。首先，为了保证准确性，必须将非微珠小颗粒的背景检测信号降至微珠检测信号的 10% 以下。接着，在记录重复样本之前，先对每个样品进行一次测量。

这将使每个样品经历变化的纳米孔条件。每个样品均应测量三次，最后仅重新测量校准微珠样品。在后续数据分析过程中，使用电子表格软件进行浓度计算。

书面方案中包含了一个计算示例。通过超速离心法从U 87 M-G-E-G-F-R-V三细胞培养物的上清液中纯化出细胞外囊泡，然后使用115纳米校准微球按照所述方案进行测量，获得了细胞外囊泡的粒径分布。

还通过另一种方法直接从胶质母细胞瘤细胞培养上清液中定量了细胞外囊泡，该方法是在样品中加入已知标准品作为参照。观察到两个纳米颗粒群体。根据已知标准品对这两个群体进行粒径估算，鉴定出囊泡群体的粒径大于140纳米。

较小的细胞外囊泡可能通过更小的纳米孔开口被检测到，但这样更容易发生堵塞。一旦掌握，该技术可在一至四小时内完成，具体时间取决于分析的样本数量。在执行此操作时，需注意样本可能需要对方案中的隔膜参数进行调整。

例如，含有较大囊泡的样品可能需要在相对较大的拉伸程度下使用较大的纳米孔，并且可以通过离心过滤样品以去除细胞碎片（这些碎片可能堵塞纳米孔）来促进测量。观看本视频后，您应能够充分掌握如何使用 TRPS 对细胞外囊泡进行表征。根据您的细胞外囊泡样品情况，可采用标准操作流程，或使用经调整的内参校正法。