含生物活性剂纳米盘的制备与表征

本方案提供了制备纳米级颗粒（即纳米盘）的实用知识，可稳定地包载多种疏水性生物活性分子。该方法具有广泛的实用价值。

赋予原本不溶于水的生物活性化合物以水溶性的能力，使得纳米盘可用于药物递送应用。所述方法简便易行。建议在所述规模下进行研究，即五毫克磷脂和两毫克支架蛋白，以便通过肉眼观察直接监测纳米盘的形成。

演示该实验步骤的是瑞安实验室的本科学生研究员 Michael Karo 和 Matthew Swackhammer。准备磷脂分装液时，称取 5 毫克 DMPC 并转移至玻璃试管中。加入 300 微升氯仿和 100 微升甲醇（体积比为 3:1），溶解磷脂。

将玻璃试管置于温和的氮气气流下10至15分钟，蒸发有机溶剂，使磷脂在试管底部内壁形成一层薄薄的干燥磷脂膜。为制备两性霉素B或AmpB-纳米盘，用移液器向冻干的磷脂样品中加入450微升磷酸盐缓冲液（PBS），涡旋振荡30秒以分散脂质。再向分散的磷脂样品中加入50微升浓度为20毫克/毫升的两性霉素B储备液，随后涡旋振荡。

向含有分散的磷脂和两性霉素B的玻璃试管中加入500微升浓度为4毫克/毫升的ApoE4 NT支架蛋白。在24摄氏度下进行水浴超声处理，直至溶液澄清。对于两性霉素B-纳米盘透析，取一段透析管，用去离子蒸馏水充分浸泡10分钟以进行准备。

使用透析管夹将浸泡过的透析管一端夹紧，确保无液体泄漏。将细颈漏斗插入透析管的开口端，将两性霉素B-纳米盘（AmpB-Nanodisk）样品转移至透析管内。取出漏斗，用另一个透析管夹将透析管的开口端夹紧。

将一个泡沫透析浮子套在透析管的一端封闭端上，将组装好的透析管放入含有新配制的一升 PBS 缓冲液的烧杯中。将磁力搅拌子放入烧杯底部，并将搅拌速度调至低速，避免产生涡流。在 4 °C 下静置透析过夜。

通过拨动电源开关打开分光光度计，并通过按下“PC控制”按钮连接至相应的支持计算机。在支持计算机上，打开标记为 UVProbe 2.61 的软件，然后单击左下角的“连接”按钮以连接至分光光度计。单击“光谱”选项，然后在顶部工具栏中单击“方法”。

单击“测量”选项卡，在波长范围下方的“起始”文本框中输入 500，在“结束”文本框中输入 300。单击标有“扫描速度”选项卡旁边的下拉菜单，将其设置为“中等”。通过将一毫升 DMSO 转移至两支石英比色皿中，制备样品空白对照。

将两个比色皿分别放入分光光度计对应的样品槽中。点击“自动调零”，然后单击左下角的“开始”按钮，记录300至500纳米范围的光谱。进行两性霉素B标准光谱分析时，从前面的样品槽中取出比色皿，加入20微升浓度为1毫克/毫升的两性霉素B储备液。

将比色皿重新放入样品架中，点击“开始”以记录样品的吸光度。记录完样品吸光度后，取出比色皿并将其中液体倒入废液容器中。用去离子水彻底冲洗比色皿，重复冲洗三次，随后用70%乙醇再冲洗三次。

对于破坏后的AmpB-纳米盘进行光谱分析，通过移液将20微升浓度为1毫克/毫升的AmpB-纳米盘储备液加入1毫升DMSO中制备样品，并在记录光谱前孵育1分钟。将比色皿放入前方样品槽中，点击“开始”以记录样品吸光度。对于PBS缓冲液空白样的光谱分析，取1毫升PBS加入两个石英比色皿中制备空白样。

将比色皿装入样品孔中。点击“自动调零”，记录300至500纳米范围内的光谱。对于未破碎的AmpB-Nanodisk样品的光谱分析，从前面的样品孔中取出比色皿，并向PBS缓冲液中加入20微升浓度为1毫克/毫升的AmpB-Nanodisk样品。

将比色皿重新放入样品架中。点击“开始”并记录样品光谱。当样品外观由浑浊变为澄清时，视为两性霉素B-纳米盘制剂反应完成。

展示了两性霉素B（AmpB）样品在DMSO和PBS中的紫外-可见吸收光谱。在DMSO中，观察到372、392和415纳米处三个明显的吸收峰，这些峰是AmpB的特征峰。AmpB-纳米盘在PBS中的吸收光谱则显示在较短波长处有一个单一的主要吸收峰。

相比之下，DMSO 中 AmpB-纳米盘的吸收光谱与储存液 AmpB 的光谱相似。通过评估酵母生长抑制实验来检测 AmpB-纳米盘的生物活性。PBS、DMSO 和重组高密度脂蛋白等对照样品表明，除 AmpB 外，纳米盘的其他组分对酵母生长无明显影响。

阳性对照证实两性霉素B（AmpB）可有效抑制酵母生长。对于AmpB-纳米盘，观察到浓度依赖性的生长抑制活性。并非所有纳米盘制备物都具有相同的活性。

某些情况可能需要更长的时间、不同的脂质或不同的支架蛋白。唯一不明确的是纳米盘样品的澄清步骤。该技术已推动了新型纳米颗粒的开发，用于研究阿霉素诱导的心脏毒性、细胞凋亡、配体相互作用，并成功递送了多种水难溶性生物活性分子，包括叶黄素和姜黄素。