使用 dsRNA 饲喂文库在 C. elegans 中进行大规模基因敲低以产生稳定的基因功能缺失表型

本实验的总体目标是利用细菌 dsRNA 饲喂文库在秀丽隐杆线虫（C. elegans）中进行大规模 RNA 干扰筛选，以敲低基因表达。首先培养来自 dsRNA 文库的细菌克隆，在防止质粒丢失的生长条件下，先对每个初级文库板进行复制，然后使用 96 孔复制文库板在琼脂 Omni 板上生成细菌的临时菌株。

将这些 Omni 培养板上的细菌在液体培养基中过夜培养，随后转移至线虫喂食板表面。文库中的每个细菌克隆均携带一种独特的 D-S-R-N-A 编码质粒，可靶向敲低一个秀丽隐杆线虫（C. elegans）基因。第二步是将同步化的线虫放置到喂食板上。

接下来，将线虫在20摄氏度的湿化培养箱中培养数天。当线虫摄食细菌时，诱导产生的双链RNA（dsRNA）会释放到动物肠道内，并进一步扩散至周围组织，从而引起系统性的基因沉默效应。最后一步是观察经喂养的线虫因基因特异性沉默所导致的表型变化。

这些表型分析用于鉴定在所研究的生物学过程中起重要作用的基因。与现有的方法（如将双链RNA显微注射到线虫性腺中）相比，该技术的主要优势在于其高通量性。利用饲喂文库，我们可以在数周内检测几乎全部海鞘基因的生物学功能。

许多实验室在采用这种基因敲低方法时遇到了困难，因为大多数基因和秀丽隐杆线虫（C. elegans）都是单倍剂量足够的。因此，RNA干扰必须将基因表达降低50%以上，才能产生功能缺失的表型。为了确保有效的基因敲低，关键在于喂给线虫的所有细菌都必须表达双链RNA质粒。

开始质粒丢失率测定实验时，按照各相关步骤所述，取出少量细菌样品，加入450 µL无菌水中。取100 µL该稀释后的样品，用无菌水进行连续系列稀释。每次稀释之间需充分混匀溶液。

将每种稀释液各100微升涂布于LB平板和LB AMP平板上，于次日在37摄氏度下过夜培养，挑选含有100至500个细菌菌落的LB平板。计数该平板上的菌落数量，以及对应相同细菌稀释度的LB AMP平板上的菌落数量。使用此公式计算质粒丢失率。

质粒缺失率的计算方法为：用LB平板上的菌落数减去LB氨苄平板上的菌落数，再除以LB平板上的菌落数，然后乘以100。为防止质粒丢失，需将细菌培养在高浓度碳酸卖啉中。为实现有效敲低，在喂食动物前需检测质粒丢失情况，仅当质粒丢失率低于15%时方可继续实验。本实验步骤开始时，从-80摄氏度冰箱中取出重复的文库平板。在菌液仍处于冷冻状态时，揭开铝箔封口。

更换培养皿的塑料盖，将含有重复文库的培养皿置于水平台面上，在室温下解冻，时间不超过30分钟。对口腔96针复制器进行灭菌处理：先将其浸入乙醇浴中，随后点燃乙醇以灼烧灭菌。

使用烧瓶和本生灯将接种针上的菌膜烧掉。待火焰熄灭后，重复此操作。清洁的接种针在每次使用前应先用蒸馏水冲洗，然后进行灭菌处理。

将灭菌的复制器放入解冻后的重复板的孔中，轻轻搅拌培养物。少量培养液会附着在复制器的针上。小心地将复制器从重复板的孔中取出，然后轻轻将针朝下放置在全能板的表面。

注意不要刺破琼脂表面。将复制器停留在 Omni 培养板表面三到四秒，使复制器针上的细菌转移到琼脂表面。为防止质粒在固体培养基上丢失，培养基中含有两毫克每毫升的 ate。

碳酸菌落。移除复制器，并让少量细菌培养物吸收至琼脂中。待两块平板均完成复制后。

将 omni 培养板倒置于37摄氏度培养15至18小时，次日早晨完成。这些 omni 培养板可用于接种96孔液体培养物，或在4摄氏度下保存最多七天。用于喂食线虫的细菌通过从 omni 培养板中取菌制备液体培养物，使用重复移液器和50毫升排头，向每个2毫升培养管中加入1毫升细菌生长培养基。

将96孔深孔板的深孔进行灭菌，灭菌后的复制器放置于含有细菌菌落的Omni板表面，确保每个针头均与96个细菌菌落接触。小心地将复制器从Omni板表面转移至深孔板中，注意针头在浸入培养基前不得刮擦深孔的侧壁，以使细菌脱离并进入培养基中。

缓慢地以方形轨迹移动复制器，沿深孔板内壁运动。注意避免溅出液体，防止孔间交叉污染。每块96孔深孔培养板应包含两个对照孔。

表达DS RNA的细菌作为预期基因敲低和表型的阳性对照，含空载体DS RNA的细菌作为阴性对照。使用无菌接种环，从阳性对照平板上挑取单个分离良好的菌落，接种至深孔板中的一个空孔内。记录接种菌落所在的孔位位置。

对阴性对照重复上述操作。将深孔板在37摄氏度下以650转/分钟的转速在微量振荡器上平放振荡过夜。培养过夜后，将96孔深孔板中的细菌转移至12孔板中。

加样板的转移可每次进行四个孔。将移液器吸头安装在12通道多通道移液器的每第三个通道上。从深孔板中吸取150 µL细菌培养物，并排加到12孔加样板表面的四个孔中。

转移过程中切勿刺破琼脂表面，因为线虫会钻入内部而无法摄取表达dsRNA的细菌。每转移完四孔后，需更换为四个新的无菌枪头，再接种下四孔。将接种好的培养板直立避光置于室温过夜，使细菌充分渗入琼脂。在将L1期停滞的秀丽隐杆线虫幼虫转移至dsRNA喂食平板进行喂食筛选之前，完成上述步骤。

必须确定先前制备的 L1 期滞育幼虫的浓度。将装有滞育 L1 期幼虫的锥形瓶混匀，以使动物分布均匀。然后吸取 10 µL 样品，逐滴加入未铺菌的六厘米 NGM 平板中。

在平板中央滴加四到五滴。确保移液器中的所有培养基均已排出。用移液器吸头末端将线虫悬液的液滴涂抹，形成一条贯穿平板直径的连续液线。

使用解剖显微镜，在液体被培养皿吸收且动物散开之前，从液滴一端开始计数所有动物，一直计数到另一端。为确保不遗漏任何个体，可能需要持续重新对焦解剖显微镜。重复此计数过程三次，每次使用 10 微升虫液样本，以确定每微升虫悬液中的平均虫数，并将该数值直接记录在三角烧瓶上。

开始喂食筛选实验时，使用 L1 期停滞的幼虫悬浮液和无菌水配制每毫升含 2000 条线虫的溶液。每块 12 孔喂食板需要取 120 微升该线虫悬浮液，充分混匀以确保动物分布均匀，并将线虫转移至无菌储液槽中用于移液。使用多通道移液器，移液枪头安装在每隔两个位置（即每第三个位置），将 10 微升线虫溶液直接加到喂食板的细菌菌苔上。

注意不要刺破琼脂表面，因为线虫会钻入琼脂中而无法摄食表达 D-S-R-N-A 的细菌。将线虫溶液转移至每两排喂养板后，需通过轻轻晃动储液容器重新混匀线虫溶液，因为线虫沉降迅速。操作初期应在解剖显微镜下检查少量孔，确保每孔含有 20 至 30 条线虫。所有喂养板接种线虫后，将平板直立放置于湿润盒中，并在 20 摄氏度培养箱内培养。次日待线虫悬液完全渗入平板后，将平板倒置，重新放回 20 摄氏度的保湿环境中。

在这些培养板上的动物可在三天后观察P零代表型，六天后再次观察F1代表型。本方案用于检测四个基因的敲低效果：egg L-30、dumpy-17、PAT-10和on four egg L-30，以及on four。其中，egg L-30、dumpy-17和on four在神经系统中表达，PAT-10在体壁肌中表达，dumpy-17也在表皮细胞中表达。

由于 Erie one Lin 15 B 突变体对 RNAi 具有增强的敏感性，因此在筛选中将其用作阴性对照。线虫被喂食含有空 PL 44 40 质粒的细菌，该质粒不表达 dsRNA，符合预期。喂食含有空质粒细菌的 RIE one Lin 15 B 动物未表现出任何形态学或行为学缺陷。

此照片显示了自由活动的动物，其正常的身体姿态即为证明。黑色箭头指示一只年轻成年动物的位置。白色箭头指示一堆已产卵的位置。

本视频片段展示了线虫的正常行为。egl-30 编码 G 蛋白亚基 Gαq 的秀丽隐杆线虫同源基因。当一龄期 eri-1; lin-15B 幼虫被喂食表达 egl-30 双链 RNA（dsRNA）的细菌后，这些幼虫发育为成虫，表现出明显的运动和产卵行为缺陷。三天后，100% 被喂食针对 egl-30 的 dsRNA 的动物出现瘫痪，无法产卵。

这张照片显示所有动物均呈现出典型的麻痹状态下的僵直外观。还应注意，培养皿上完全没有产下的卵。Dumpy 17 编码一种胶原蛋白，该蛋白在海鞘的角质层形成过程中是必需的。

elgan 和 dumpy 17 缺失突变体比野生型动物更短且更粗。在本实验中，饲喂 dumpy 17 D-S-R-N-A 的 P0 代动物未观察到形态学缺陷。然而，如本图所示，98% 的 F1 代动物表现出 dumpy 表型。

请注意，图中箭头标记的野外成年动物比黑箭头标记的成年动物更短且更粗壮。在 A 图中，缺乏短而粗壮的 P 零动物表明，dumpy-17 基因功能在幼虫早期阶段对正常体态发育是必需的。Pat-10 编码体壁肌钙蛋白 CA 蛋白，该蛋白包含四个可结合钙离子的 EF 手型基序。

本研究观察到，喂食Pat10 dsRNA的100% Erie一Lin15B动物在三天内全部出现瘫痪，并且不再产卵，导致致死表型。需要注意的是，尽管动物已瘫痪，它们仍可移动头部肌肉以进食，这一点可通过箭头所标记的头部附近细菌被清除的现象得以证实。four编码一种同源结构域蛋白，在腹神经索运动神经元中表达，并对正常的突触输入至关重要。本研究选择four作为测试基因，是因为此前已证实其对多种dsRNA喂食策略具有抗性。

本研究结果显示，与野生型动物相比，喂食文库构建中四种表达dsRNA细菌的动物中有62%表现出运动行为缺陷。野生型动物在头部受到刺激时能够自由地以正弦波形式后退；而unc-4基因功能完全缺失的突变体则无法后退，反而会强烈收缩身体，导致背屈反应，这种现象往往极为明显，致使动物头部与尾部相接触，身体呈盘绕状。该表格显示了在分别喂食针对所测试四个基因的dsRNA后，表现出类似功能缺失表型的动物百分比；每次基因敲低实验均检测了100只动物。这些结果表明质粒的稳定维持对于dsRNA实验的成功至关重要。

干扰筛选可在所有组织中观察到稳定且高外显率的功能丧失表型。当喂食线虫的全部细菌均表达双链RNA后，一旦掌握该技术，一个人大约可在两个月内完成整个喂食文库的筛选。为了提高通量，在喂食筛选中我们仅对每个细菌克隆进行一次测试。

在初次筛选文库中鉴定出的任何基因都将进行重复验证。我们要求该基因在三次重复实验中均能观察到预期的表型，才能被确认为阳性结果。随后，从细菌中提取质粒并进行测序，以确认所编码基因的身份。

一旦鉴定出某个基因，我们会订购相应的L型突变体（如果可获得），并在对该基因进行任何进一步表征之前，检测其是否具有预期的表型。