酿酒酵母中蛋白质浓度依赖的形态表型发育分析

本方案利用一种可调控的启动子，实现对蛋白表达的控制。在本实验中，我们使用一种高拷贝的2微米质粒，该质粒在甲硫氨酸可抑制启动子的驱动下表达N端二聚化结构域。将该质粒转化至野生型酵母细胞中。

在缺乏uol的平板上筛选质粒和转化子。经 overnight 培养后，在选择性培养基中通过无皮质醇介导的生长阻滞使细胞同步化。

最后，在时间过程实验期间，通过将细胞转移至不含甲硫氨酸的培养基中以诱导 and to 的表达。通过蛋白质印迹法监测蛋白浓度，通过显微镜观察形态学表型的发育。大家好，我是普渡大学生物科学系的 Claudia。

我是来自 alar 的 de Bari Muji，同时也在 AL 实验室。今天我们将向您展示一种分析形态学表型发育随体内蛋白浓度变化的实验方法。在我们的实验室中，利用该方法研究在内吞作用适配蛋白 absent two 的 N 二结构域过表达时所观察到的细胞分裂表型的形态学和分子特征。

那么，让我们开始吧。本实验方案首先构建一种能够表达目标蛋白的酵母菌株。在我们的实验中，我们将含有 nth2 基因的高拷贝质粒 DNA 转化至野生型酵母菌株 W 3 0 3 中，该质粒中的 nth2 基因受甲硫氨酸可抑制型启动子调控，2 毫摩尔甲硫氨酸可抑制 met25 启动子的活性。

尽管缺乏甲硫氨酸的培养基可实现最大表达，但仍需从含有近期转化细胞的平板上挑取六个菌落，接种于50毫升含0.2毫摩尔甲硫氨酸的选择性培养基中，置于锥形瓶内，于30摄氏度、200转/分钟振荡条件下过夜培养。次日早晨，通过测定600纳米处的光密度值估算细胞密度。取相当于每毫升20个OD600纳米单位的细胞，转移至无菌离心管中，通过离心收集细胞。

通过涡旋将细胞重悬于YPD培养基中，以同步细胞周期，并从DMSO中浓度为1毫克/毫升的储备液中加入药物至终浓度为15微克/毫升。在30摄氏度下以200转/分钟振荡培养4小时。4小时后，检测处于有丝分裂阻滞的细胞百分比。

在显微镜下观察并计数具有大小相等芽体的细胞数量，然后进行下一步。只有当细胞阻滞率大于90%时，以2200转/分钟离心5分钟收集细胞。用预冷的冰水洗涤三次后，将细胞沉淀重悬于缺乏甲硫氨酸的选择性培养基中，细胞密度约为每毫升0.5 OD（600纳米波长处）。

将一半体积的细胞转移至新的无菌离心管中，并加入甲硫氨酸至终浓度为 0.2 毫摩尔。这将作为由于基础水平蛋白表达所引起效应的对照。将两份培养物均放回 30 °C 恒温培养箱中。

在每个时间点的六小时内，每小时分析一次细胞表型的发育情况。取1毫升各培养物的细胞悬液，转移至无菌的微量离心管中，通过离心收集细胞，吸除上清液，并将沉淀重悬于70 µL培养基中。然后，从浓度为1毫克/毫升的无菌水储备液中加入30 µL的亚甲基蓝溶液。

接下来，取约六微升该悬液滴加到洁净的玻璃载片上，然后将盖玻片覆盖在液滴上。轻轻按压盖玻片，使细胞在玻璃界面之间形成一层薄而均匀的分布。将盖玻片分为九个象限，每个象限拍摄三张图像。

每个视野中的细胞数量不应超过30个，以确保准确的定量分析。统计显示目标表型的细胞数量，在本示例中为具有拉长和/或串联芽体且未能彼此分离的出芽酵母细胞。我们还统计因染色呈蓝色而被识别的死亡细胞数量，因为nth诱导后会引起细胞分裂缺陷。

两种过表达导致细胞死亡，以在每个时间点观察特定表型缺陷。取一毫升培养物至无菌微量离心管中，通过离心收集细胞。将细胞沉淀重悬于100微升含1毫克/毫升刚果红的无菌水中，室温避光孵育5分钟。

使用钙白染色可实现对细胞壁的可视化观察。用1×PBS将沉淀洗涤三次。将最终沉淀重悬于100微升PBS中。

在显微镜下观察细胞，并使用紫外光学系统在100倍放大倍数下获取细胞壁的图像。为观察GFP标记的septin，使用FS E滤光片获取图像。通过之前所示的方法，将盖玻片分为九个象限，每个象限拍摄三张图像用于计数，从而量化具有细胞壁缺陷和septin错位定位的细胞百分比。单个酵母细胞的显微成像需要使用嵌入培养基的琼脂床来制备琼脂床。

首先用70%酒精清洁带有凹陷的玻璃载玻片，并在载玻片晾干的过程中使其自然风干。将0.06克琼脂加入5毫升缺乏甲硫氨酸的筛选培养基中，在微波炉中加热至沸腾，直至琼脂迅速完全溶解。用移液器吸取200微升含琼脂的培养基滴加到载玻片上。

将另一块干净的载玻片倒扣在凹槽上，确保下方无气泡残留。待凝胶凝固后，平稳地将上方载玻片从凹槽载玻片上移开，始终保持两者的表面相互平行。此操作可确保琼脂糖床的表面与凹槽载玻片的表面齐平。

用柔软的纸巾清洁农杆菌培养区周围的载玻片区域。载玻片现已准备好，可在四小时时间点使用。将一毫升培养物中的细胞转移至无菌微量离心管中，并通过离心收集细胞。

吸弃上清液，并将细胞重悬于100微升不含甲硫氨酸的新鲜选择性培养基中。在盖玻片边缘涂抹凡士林。然后取一滴细胞悬液置于载片的琼脂区域中央，并轻轻按压盖玻片使其均匀铺展。

用指甲油沿盖玻片边缘封边以固定其位置。待指甲油干燥后，将玻片置于显微镜的加热载物台上。我们使用配备有 Zeiss Axio cam MRM 黑白数码相机的 Zeiss Axio 200 M 显微镜，选择一个细胞数量不超过 10 个且分布足够分散的视野，因为随着时间推移，视野中的细胞会变得密集。

细胞分裂过程中，每隔五分钟拍摄一次视野图像，持续约五小时。为避免反复重新调焦，我们编程设定图像采集软件在每个时间点自动获取几张Zack图像。

稍后将选择对焦最清晰的图像用于制作视频，以确保细胞获得足够的热量；除了使用加热载物台外，还可通过在整个成像过程中保持显微镜透射白光开启，提供额外的热源。通过使用 Image J 软件将图像合成为视频，可研究表型逆转现象。此处我们展示了过表达目标蛋白的代表性结果。Nth two。

首先，检测 nth two 的蛋白表达。在实验的时间过程中，收集表达 HA 标签 nth two 的细胞裂解液，并使用单克隆抗 HA 抗体进行 Western 印迹分析。如免疫印迹所示，含有 0.2 毫摩尔甲硫氨酸的培养基中培养的细胞，其蛋白表达水平极低。然而，在缺乏甲硫氨酸的培养基中培养的细胞，S two 蛋白浓度在整个实验时间过程中呈现持续上升的趋势。

随后分析了在有或无甲硫氨酸的条件下培养六小时的细胞，因为低浓度的 nth two 无法单独诱导细胞分裂表型或细胞死亡。经亚甲蓝染色后，仅有少量细胞呈蓝色，表明其已死亡。同样，每个细胞的细胞核数量、细胞壁以及 septin 的排列均正常，符合预期。

相比之下，M基因的过表达会导致严重的细胞分裂缺陷和细胞死亡，这可通过甲烯蓝染色后仍保持蓝色的长串相连的伸长芽体来证明。大多数表型细胞均为多核细胞，这一点可通过DPI染色确认。钙荧光白染色显示异常细胞壁斑块的积聚。

此外，septin 出现明显的错位和紊乱。该表型随时间变化的定量分析结果如图所示，其中空心圆圈代表 0 毫摩尔甲硫氨酸，实心圆圈代表 0.2 毫摩尔甲硫氨酸。我们在此可见，随着 nth2 浓度在细胞内随时间逐渐积累，表现出细胞分裂表型的细胞百分比也随之上升。

在0.2 mM甲硫氨酸条件下培养的对照细胞表明，表型发育是蛋白质浓度升高的结果，而非细胞培养条件所致。最后，通过延时视频显微镜记录了nth2过表达后表型的发育过程。

经过四小时的 nth 处理后，两种过表达细胞显示出轻微的形态学细胞分裂表型。随着影片的进展，我们观察到顶端芽体生长出现异常且持续时间延长，导致芽体变得非常细长。我们还观察到，在细胞尚未完成分裂的情况下，新的芽体便已开始出现。

此外，可以观察到芽体从母细胞的多个区域萌发，从而形成分支状外观。我们刚刚向您展示了如何在出芽列表中，根据蛋白质浓度来表征和分析形态学表型的发展。进行此操作时，务必记住以推荐的离心速度对细胞进行处理，因为过高的速度可能会损伤细胞。

还需要注意的是，应在成像前立即加入亚甲蓝和氯化物，因为它们对光东细胞具有毒性。感谢观看，祝您的实验顺利成功。