用于研究功能、相互作用及翻译后修饰的芽殖酵母蛋白质提取与纯化

本实验的总体目标是在保持蛋白质天然结构、功能相互作用及翻译后修饰的前提下，从酵母中提取目标蛋白质。该目标通过以下步骤实现：首先培养细胞以诱导目标蛋白的表达；随后，将收获的酵母细胞在适当的缓冲液中进行匀浆处理，从而提取蛋白质。

然后使用亲和树脂从澄清的全细胞提取物中纯化目标蛋白。该实验步骤的最后一步是从亲和树脂中洗脱纯化后的蛋白，以便进行后续分析或下游应用。最终可通过Western印迹分析获得结果，用以显示蛋白纯化过程中的修饰情况及其相互作用。

演示该实验步骤的是伊娃·基（Eva Ky），她是威廉与玛丽学院的毕业生，在过去的几年中作为本科研究员在我实验室工作。与现有其他方法相比，珠磨法的主要优势在于能够在保持蛋白质功能、相互作用及翻译后修饰的前提下，快速处理并裂解多个样品。首先，将编码半乳糖诱导型六聚组氨酸标签蛋白的质粒转化至gal阳性酵母菌株中，将转化子接种于5毫升含有2%蔗糖的适当选择性培养基（如SD-尿嘧啶培养基）中，30°C、振荡条件下过夜培养。次日，将过夜培养物按适当比例稀释至含2%蔗糖的选择性培养基中，终体积为33毫升，使600纳米处的光密度值达到0.3，随后在30°C、150 RPM的摇床中继续培养。

当培养物的 OD 600 达到 0.8 至 1.5 时，通过加入 17 毫升含 6% 半乳糖的三倍 XYEP 培养基，使其终浓度为含 2% 半乳糖的一倍 XYEP 培养基，并在 30 摄氏度摇床培养箱中继续培养 5 至 6 小时，以诱导目标蛋白的表达。测定诱导后培养物的 OD 600 后，于 4 摄氏度、5,000 转/分钟离心 5 分钟，收集 150 至 200 OD 600 单位的细胞，然后加入 1 毫升预冷的含一倍蛋白酶抑制剂混合液的一倍 XPBS 重悬细胞沉淀，并转移至 2 毫升螺口管中，于 4 摄氏度、15,000 转/分钟离心 1 分钟。弃去上清液后，用液氮速冻细胞沉淀，保存至细胞沉淀完全冻结。

加入200微升酸洗玻璃珠和500微升冰冻裂解缓冲液。始终将离心管置于冰上。使用末端切去的移液枪头，在4摄氏度下轻轻吹打数次。

将细胞管放入珠磨机平衡锁中，按照制造商的说明以每秒5.5米的速度运行20秒。然后将试管置于冰水混合物中静置1分钟。重复上述步骤共六次，以充分裂解细胞。随后，在4°C、15,000 RPM条件下离心15分钟，以分离提取的蛋白质。

然后准备全细胞提取物（WCE）样品用于蛋白质印迹分析，取相当于两个OD 600单位的细胞加入800微升20%三氯乙酸（TCA），涡旋混匀。为纯化澄清的WCE样品，取50至100微升亲和树脂加入新的微量离心管中，加入1毫升洗涤缓冲液，上下颠倒混匀以重悬树脂，洗涤并平衡树脂。在5,000转/分钟及4摄氏度下离心1分钟后，吸去上清液。为进行亲和纯化，将100至200微升澄清裂解液加入已洗涤的树脂珠中，并用裂解缓冲液将总体积调至1毫升。

在4°C条件下，将样品与突变剂或摇动孵育2至5小时。在裂解液与beet溶液孵育进行WCE蛋白免疫印迹样品处理期间，用液氮速冻剩余澄清的WCE等分试样，并于-80°C保存以备后续使用。在4°C、15,000 RPM条件下离心2.5分钟，小心倾倒上清液，注意保留沉淀；向沉淀中加入800 µL的2% TCA，涡旋混匀后，再次以相同条件离心2.5分钟。

小心倾去上清液后，加入100微升TCA样品缓冲液，涡旋震荡以溶解沉淀，然后将样品进行孵育。在100摄氏度的加热块中孵育2至5分钟，再次处理以彻底溶解可能难以溶解的沉淀残留物，随后在-80摄氏度下保存，直至使用。待裂解珠样品孵育完成后，于4摄氏度、5,000转/分钟离心1分钟，再用洗涤缓冲液洗涤树脂5次，以洗脱蛋白质。

在4°C条件下，向树脂突变体中加入150 µL洗脱缓冲液，孵育5分钟。在5,000 ×g、4°C条件下离心1分钟，将上清液收集至新离心管中。最后，为制备用于Western blot的样品，取25 µL蛋白样品，加入25 µL 2×锂二辛基硫酸盐上样缓冲液和2 µL BME。

如图所示，可以从酵母细胞中可重复地提取多种蛋白质。在不同分子量范围内出现的清晰条带表明蛋白质提取物质量较高。可通过针对特定表位标签蛋白的蛋白质印迹法（western blotting）进一步确认提取物的质量。

以下是半乳糖过表达的V5标签Sumo连接酶的代表性结果，其迁移位置约为120千道尔顿。通常情况下，部分降解的蛋白质会在预期分子量下方以多个片段的形式出现，但在此结果中仅观察到全长蛋白。此外，特定蛋白质出现高分子量条带可能提示存在翻译后修饰。

例如，您在此处可以看到乳糖过表达的与 SUMO 相关的 S1-Δ440 和全长 SIS1。如该 Western 印迹所示，这些修饰也可在内源性表达的 S1 上得以保留。该图显示，两种核富集蛋白 SLX5 和 CS1-Δ440 已从我们的 ws 中成功纯化。

值得注意的是，六聚组氨酸标记的蛋白可以从W'S中进行亲和纯化，无论是在天然还是变性条件下均可实现。相比之下，SLX 5G ST以及CIS1 Δ440ha缺乏六聚组氨酸表位，但在天然条件下仍能以对巯基乙醇敏感的方式与金属亲和树脂结合。我们提出，CIS1以及在较小程度上SLX5可通过其金属协调环结构域与金属亲和树脂结合。

据我们所知，尽管这一特定现象尚未见报道，但已有类似情况被描述：霍乱毒素B亚基可通过其天然的组胺残基介导，结合Nicola亲和树脂。该观察结果提示，WCER中的蛋白质至少部分以天然折叠形式存在，适用于蛋白质功能的研究。重要的是要证明蛋白质复合物在全细胞提取物中保持完整。

代表性数据表明，在 WS cis 1 中存在 CS one delta four 40、SLX 5 以及作为细胞质蛋白且用作上样对照的 P GK 1a。Delta four 40 利用其与金属亲和树脂结合的固有特性，从这些提取物中被纯化出来。此外，当 SLX 5 与 SIS 1 在酵母细胞中共同表达时，EITs 中 SLX 5 的水平升高，提示 SLX 5 可能与 SIS 1 发生相互作用。

观看本视频后，您应能够充分理解如何培养和处理酵母细胞，以在天然条件下提取、纯化并观察酵母蛋白。