Neisseria meningitidis 与人类α-肌动蛋白结合蛋白的细胞内相互作用的共聚焦成像可视化与定量分析

以下实验的总体目标是评估内化细菌——脑膜炎奈瑟菌（RIA Meningitidis）与细胞骨架蛋白α-辅肌动蛋白（Alpha Actinin）的共定位水平。首先，将培养的人脑微血管内皮细胞与过夜培养的细菌共孵育3至8小时，使细菌进入靶细胞。第二步，对含有胞内细菌的细胞进行洗涤、固定和通透处理，从而为后续对内化细菌及胞内α-辅肌动蛋白进行免疫染色做好准备。

在完成共聚焦成像并应用共定位分析软件后，可观察到细胞内共定位的图像，并获得定量结果，结果显示表达 OPC 的 Meninga Croci 以及膜蛋白可特异性地与细胞内 α-辅肌动蛋白相互作用，该结论基于共聚焦显微镜观察及定量共定位分析得出。大家好，我是来自布里大学细胞分子医学系 Mata TI 教授实验室的 Isel Maria。今天我们将向您展示一种用于评估细胞内细菌与细胞骨架蛋白共定位水平，即共定位比率的实验方法。

我们在实验室中采用此方法研究表达自膜蛋白OPC的菌丝体脑膜炎与细胞骨架蛋白α-肌动蛋白之间的相互作用。现在让我们开始吧。该工作必须在符合标准的安全实验室中进行。

在免疫染色操作前两天，将目标细菌菌株接种于添加了10%加热马血的脑心浸液琼脂平板上。在免疫染色前一天，于37°C、5%二氧化碳环境中过夜培养。使用10 µL的接种环制备过夜细菌培养物的悬液。

在 2 毫升 PBSB 中，将悬液于室温静置 5 分钟，使较大的细菌聚集体沉淀。随后，将上层 1 毫升悬液转移至无菌试管中，注意不要扰动沉淀。通过向含有 20 微升细菌悬液的两个小瓶中各加入 1 毫升 1% SDS 和 0.1 摩尔氢氧化钠，以溶解细菌，并颠倒试管以混匀。用于估算细菌数量。

通过测定溶液的吸光度来测量核酸含量。在216处将细菌悬液用感染培养基调节至所需密度，以用于感染人脑微血管内皮细胞。用于免疫染色的人脑微血管内皮细胞（H-B-M-E-C-A）于两天前接种：将16毫米玻璃盖玻片放入12孔板的孔中，并在盖玻片上以50%融合度接种HBME细胞，于37摄氏度、5%二氧化碳气氛中培养过夜；次日进行后续操作。

使用实验室 freshly prepared 的细菌悬液感染细胞。通常采用每靶细胞 200 至 300 个菌落形成单位的感染比例。感染结束后，在 37°C、5% 二氧化碳条件下孵育 3 至 8 小时。

用 PBS 洗涤细胞三次，然后加入 500 微升 2% 多聚甲醛，在室温下固定 30 至 45 分钟。洗去多聚甲醛后，将细胞在 PBS 稀释的 0.1% Triton X-100 中孵育 10 分钟，以进行透化处理。最后用 PBS 洗涤样本三次，随后进行免疫染色，如图所示。接下来可同时进行细胞内细菌和 δ-辅肌动蛋白（dfor actinin）的染色。

在12孔板中，每孔加入500微升含3% BSA-PBST的封闭液，将含有通透细胞的盖玻片于室温下封闭30至60分钟。用PBS洗涤后，将每片盖玻片转移至12孔板中的新干燥孔中，同时加入针对细菌和α-辅肌动蛋白的一抗抗体，每片盖玻片加入80至100微升抗体溶液即可，注意小心添加以完全覆盖盖玻片表面，于室温孵育1小时。孵育结束后，向孔中加入200微升PBS，轻轻提起盖玻片并将其转移至另一新孔中，该孔内含500微升PBS。5分钟后，用移液器吸除PBS，然后加入新鲜PBS。重复此洗涤步骤两次，再将盖玻片转移至新的干燥孔中。

接下来，加入用1% B-S-A-P-B-S-T稀释的相应二抗（与不同的荧光染料偶联），室温避光孵育一小时。孵育结束后，按前述方法进行洗涤，然后用DPI在室温下避光对DNA进行复染，持续五分钟。此步孵育结束后，用PBS洗涤盖玻片一次，随后滴加一滴封片剂进行封片。封片后的盖玻片应避光保存，直至准备观察。在显微镜下，我们使用配备倒置落射荧光显微镜的共聚焦激光扫描显微镜观察并采集免疫标记样品的图像。

开始共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）操作时，先在物镜上滴加一滴浸液，然后将带有盖玻片的样品置于显微镜载物台上并缓慢滑入到位；将显微镜设为明场观察模式，通过目镜找到感兴趣的区域。现在可以开始使用 Leica 软件。选择 XY Z 轴采集模式，并为共定位研究选择 5×12 乘以 5×12 的格式。

分辨率越高，图像越准确。然后选择双向 X 模式，这将提高扫描速度并有助于减少光漂白。设置逐行扫描参数。

点击 SEC 功能，然后在谱线之间进行选择。根据与二抗偶联的荧光染料选择激光束：DPI 选择 405 纳米，Alexa Fluor 488 选择 488 纳米，Alexa Fluor 561 选择 561 纳米。

依次激活三光子显微镜的第一、第二和第三光电倍增管。设置Z轴扫描或序列的顶部和底部位置。接下来，将Z轴步进大小设为0.2微米。

RIA Mencius 是一种双球菌，由于每个球菌的直径约为 0.5 微米，因此将 Z 轴步长设为 0.2 微米可提高每个球菌至少被扫描两次的概率。通过选择三次线平均以提高信噪比，并点击“开始”来设定最终扫描参数。通过在不同波长下依次扫描，并对每个通道采用“行间模式”消除不同发色团之间的串扰，从而获得双染或三染图像。

为了显示两种荧光染料的共定位情况，请选择叠加功能，将选定的通道合并为单幅图像。例如，当 Alexa 488 与 trissy 荧光染料共定位时，叠加图像中会呈现黄色。为了可视化可能的共定位，需要进行二维重建，此时应使用最大投影功能整合 Z 轴层扫（Zed stack）或序列图像。在获取 Z 轴层扫或序列图像后，需对数据进行处理，生成正交图像，以可视化细胞内不同组分的定位情况。

使用 IMP 公司提供的 Vol City 软件进行共定位的定量分析。首先创建一个包含共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）图像的库，然后从顶部工具栏的图像中选择“扩展焦点”功能。该工具将把多个 Z 轴层面整合为一幅 2D 图像用于分析。

现在选择共定位（COLOCALIZATION）工具。待分析的两个通道应具有相同的色彩深度。选择将要进行定量的区域。

设置阈值以去除任何背景。通过选择生成共定位来创建共定位输出。将针对先前选定的兴趣区域生成共定位统计结果。

接下来，选择 Mander 系数 R 和 Ny。最后，将统计值导出至 Excel 文档以进行数据展示，此处显示的是人脑微血管内皮细胞感染脑膜炎奈瑟菌八小时后的代表性共聚焦成像结果，细菌的位置以红色显示。

绿色箭头指示α-辅肌动蛋白的位置，显示在细菌周围有大量α-辅肌动蛋白聚集的区域。在此叠加图像中，多处呈现黄橙色区域，提示脑膜炎奈瑟菌与α-辅肌动蛋白存在共定位现象。在下一张图像中，对感染的H-B-M-E-C单层细胞进行光学切片，显示在细胞基底部的胞内细菌周围存在共定位现象。

当对感染的H-B-M-E-C单层细胞进行三维成像处理后，从斜向视角观察其顶面，可见由红色箭头指示的达氏菌（Durant bacteria）呈红色荧光，多个细菌位于内皮细胞基底面附近，由黄色箭头指示。在该末端XZ截面图中，可更清晰地观察到呈明显橙黄色的基底区域定位。相比之下，在远端α-辅肌动蛋白（actinin）实验中，对内化细菌以及menton或肌动蛋白进行标记的结果显示，细菌与肌动蛋白偶有共定位，但在H-B-M-E-C细胞中与fermenting蛋白的共定位极为罕见。

如先前实验所观察到的，Retin 蛋白聚集在多个被内吞的细菌周围，白色箭头指示了这些位置。数据还经过分析以获得相对重叠系数 R。根据 Manda 的定义，该系数代表真实的共定位程度（IE），即共定位的像素数与总像素数之比。在表达脑膜炎奈瑟菌的 OPC 感染的 H-B-M-E-C 细胞中，α-肌动蛋白、menting 蛋白和肌动蛋白的整体 NY 值显示，Retin 与脑膜炎奈瑟菌的重叠率超过 25%。

系数Y用于衡量每次稀有脑膜炎球菌信号出现时，更丰富的肌动蛋白α信号发生的频率。该指标显示出在内化脑膜炎球菌附近α-辅肌动蛋白显著的出现水平。在本实验中，我们将向您展示如何对内化细菌与细胞骨架组分之间的相互作用进行可视化和定量分析。

务必严格遵守固定和免疫染色操作流程，以保持结构的完整性并避免产生高背景信号。以上就是全部内容。感谢您的观看，祝您的实验顺利成功。