利用单分子定位显微镜分析人iPSC来源心肌细胞中的α-肌动蛋白结合蛋白网络

该方法可用于对诱导多能干细胞来源的心肌细胞中肌节成熟度进行定量评估。利用这种基于超分辨率的技术，能够检测到肌节结构中极其细微的变化，而这是传统共聚焦成像所无法实现的。使用前至少三小时，开启显微镜并将样品恢复至室温。

当显微镜准备就绪后，向已标记细胞的孔中加入 300 µL PALM 成像缓冲液，并将腔室载玻片插入显微镜的载物台支架中。选择 1.57 NA 100X 油镜，使用成像软件中的 PALM 模式并激活 TIRF 设置。将帧数设置为 5,000 至 10,000，紫外激光功率设为 0.1%，647 激光设为 0.2%，增益水平设为 50 至 100。

当所有采集参数设置完毕后，打开激光照明并选择目标细胞。为获取图像，将647激光功率增加至100%，并将增益降至零。对目标细胞漂白约五秒钟后，将增益调至50，开始PALM图像采集。

进行PALM数据重建时，在采集结束后，在ImageJ中打开数据并启动Thunderstorm插件。在插件中选择运行分析，并打开相机设置菜单。输入像素尺寸和电磁增益。

在运行分析菜单中，将B样条阶数设置为3，B样条尺度设置为2，峰值强度阈值设置为stfwave.f1，拟合半径设置为3，初始sigma设置为1.6，放大倍数设置为5，更新频率设置为50，横向位移设置为2，然后点击“确定”。重建完成后，在绘图直方图菜单中选择sigma，使用矩形工具选择一个感兴趣区域，排除可能的伪影。将该感兴趣区域添加到滤波器中，并将感兴趣区域的值的不确定性设置为小于25。

在“去除重复”选项卡中，输入 10 纳米的距离阈值。在“合并”选项卡中，将最大距离设为 20，每个分子的最大帧数设为零，最大关闭帧数设为一。在“漂移校正”选项卡中，选择互相关法，并将分箱数和放大倍数均设为五，然后保存最终的 PALM 图像并导出后处理数据。

为了分析肌节长度，将感兴趣的重建PALM图像导入ImageJ，并使用线条工具在选定的肌节结构之间沿垂直于Z线的方向画一条线，以测量肌动蛋白丝之间的最短距离。在分析菜单中选择“绘制轮廓”功能，并获取两个峰之间的长度。为了分析Z线厚度，将重建的PALM图像转换为8位模式图像，并打开Ridge Detection插件。

将线宽设为 20，高对比度设为 230，低对比度设为 10，sigma 设为 0.79，下阈值设为 25.84，最小线长设为 20。选择“估计宽度”、“延伸线条”和“显示结果”，然后点击确定，并使用结果表中的平均线宽进行后续分析。iPSC 来源的心肌细胞与新生细胞表现出相似的 α-肌动蛋白模式，具有不规则且排列紊乱的肌节结构。

定量评估表明，两组细胞中α-辅肌动蛋白纤维的长度和厚度几乎相同，提示iPSC来源的心肌细胞处于一种未成熟的发育状态。相比之下，成年成熟心肌细胞表现出规则的肌节网络，肌节长度略有增加，Z盘厚度减小。传统共聚焦成像与PALM成像在肌节长度的测量上无显著差异。

然而，当对iPSC心肌细胞进行PALM成像时，可检测到Z盘厚度显著降低。应用PALM技术后观察到分辨率提高，相应的强度图谱也支持这一结果。值得注意的是，使用低质量缓冲液获得的肌节结构似乎比在最佳成像条件下捕获的结构更厚。

这种数据准确性的降低是由于荧光分子的闪烁特性减弱，导致每次定位事件中检测到的光子数减少。此外，定位精度下降，降低了重建的PALM图像的整体分辨率。同时，样品漂移可能影响荧光分子的精确定位，从而导致图像模糊。

为了获得高质量的PALM图像，必须使整个成像系统充分达到热平衡，以避免成像过程中出现过度的样品漂移。通过该方法，还可利用PALM对线粒体等其他细胞结构进行成像，从而获取心肌细胞成熟度的更多参数。