利用先进的转盘-全内反射荧光显微镜技术可视化细胞中的黏附形成

转盘式全内反射荧光显微镜（spinning disk TIRF microscopy）可作为研究蛋白质在细胞骨架网络形成过程中作用的有力工具。该技术能够对细胞内发生的快速动态过程进行三维成像，同时精确地定位位于质膜上的荧光分子。该方法可为微生物学、细胞生物学以及所有需要研究质膜与细胞环境之间相互作用的科研领域提供重要见解。

该方法可拓展应用于那些需要对细胞质膜结构进行精确定位，同时还需要保持细胞其余部分高分辨率成像的活体成像实验。关键考虑因素包括选择合适的细胞系以建立全内反射荧光（TIRF）照明条件，以及其他成像参数的设置，并准确定位转染细胞的焦平面。对该实验方案的可视化演示将有助于避免在图像采集过程中对细胞操作时可能出现的问题。

实验前两天，将 3,000 个 HELA 或 NIH 3T3 细胞接种到六孔细胞培养板的每个孔中，每孔加入两毫升完全培养基。次日，准备转染试剂。首先，将一微克 RFP Livact 和一微克 YFP Vinculin 溶于总共 200 微升的低血清培养基中。

短暂涡旋混匀转染试剂。然后将4 µL该混合物加入200 µL DNA中。再次涡旋混匀试剂，随后将转染混合物在室温下孵育15至20分钟。

孵育后，将全部转染混合物逐滴直接加入细胞中。通过轻轻摇动培养板混匀各孔，然后放回培养箱继续孵育。在实验当天，首先用含10 µg/mL纤连蛋白（Fibronectin）的PBS溶液包被35毫米玻璃底培养皿，以制备用于活细胞成像的样品。

将溶液在室温下静置于玻璃表面30分钟，然后移除溶液并让培养皿自然风干。接着，将直径为0.1微米的多荧光微球溶液用蒸馏水稀释至每毫升含18亿个微粒。将该溶液加入纤连蛋白包被的玻璃表面，作用30至60秒。

然后移除溶液，让培养皿自然风干。培养皿预先包被荧光微珠仅在两种情况下需要：第一，若需在接种细胞前确定全内反射荧光（TIRF）成像平面；第二，若需获取双色微珠图像用于图像配准。现在，通过在生长培养基中加入0.1摩尔的抗坏血酸溶液，使其终浓度为0.1毫摩尔，制备含抗氧化剂的生长培养基。

将培养基置于37摄氏度水浴中预热。随后，用2毫升PBS洗涤细胞，并向每孔中加入250微升胰蛋白酶-EDTA溶液。于37摄氏度孵育细胞，等待2至3分钟，直至细胞完全脱落。

轻轻重悬细胞于1毫升预热的抗氧化培养基中，并将其加入含有4毫升该培养基的15毫升细胞培养管中。将细胞悬液置于37°C、5%二氧化碳恒温培养箱中培养，培养管盖稍松。开始实验前，启动显微镜的环境控制系统，以达到稳定的细胞培养条件。

然后将含有1毫升预热的抗氧化培养基的玻璃底培养皿放入预热显微镜的样品架中。接着，在成像软件中设置显微镜的采集参数，将采集时间间隔设为30秒，持续时间设为60至90分钟。

同时，通过将数值设置为1，激活基于硬件的自动对焦功能，使其在每个时间点均生效。现在将相机曝光时间调整为200毫秒，增益水平调整为500，各通道激光功率调整为20%。建议采用高增益水平、低曝光时间和低激光功率，以减少光毒性。

接下来，将转盘通道的Z轴层扫设置为10微米，层间间距为0.4微米，然后将底部偏移设为零，以使最低平面与硬件自动对焦的焦点位置一致，并关闭TIRF通道的Z轴层扫。最后，启用多点功能的载物台位置。这将允许在30秒的时间间隔内记录最多三个位置。

现在使用落射荧光照明找到荧光微珠，激活一个TIRF通道，并将照明角度设置为表示TIRF照明的数值。接着，按下显微镜面板上的按钮启动自动对焦功能，并使用偏移调节轮调整焦距。一旦聚焦清晰，使用TIRF 488和TIRF 561获取双色数据集，用于后续基于微珠的图像配准。

从培养箱中取出细胞，通过将封闭的试管倒置两到三次来混匀细胞悬液。然后向成像培养皿中加入一毫升细胞悬液。使用低强度落射荧光照明迅速找到双转染细胞。

找到后，使用明场照明在实时相机预览中将细胞居中，并标记位置。然后寻找另外一到两个感兴趣的位点，将其保存至位置列表，并通过点击序列按钮开始数据采集。在初始阶段，由于载物台移动，细胞可能容易脱落，因此最好设置四到五个位置，之后再舍弃其中一两个。

为了在 Fiji 中生成无需配准的超堆栈，首先将提供的文件 SD-TIRF_helper_jove.ijm 下载并保存到 Fiji 子文件夹 macros 中。然后依次点击菜单命令“plugins”（插件）、“macros”（宏）和“run”（运行）来执行该宏。

如果颜色通道需要进行配准校正，请选择该选项，并创建一个新的基于微珠的配准参考文件，称为地标文件。接下来，使用 Bio-Formats 导入器导入数据，并选择“超堆栈”作为查看选项。加载图像数据集时，第一步选择转盘系列，第二步选择全内反射荧光（TIRF）系列。

此时，Fiji 将按通道和成像位置显示排序后的数据。通过加载预先确定的标记点文件，对相应通道应用配准校正。然后为每个转盘和全内反射荧光（TIRF）通道选择合适的颜色查找表，并将它们合并为一个单一的多维超栈图像。

在处理TIRF图像时，需在底部平面添加若干个zed平面，该数量需与转盘数据集中的平面数量相匹配。这对于最终超堆栈的可视化呈现至关重要。利用本视频中所述的实验设置，选取了表达YFP和RFP的细胞，并在60分钟的时间序列中观察其黏附过程。

与预期一致，细胞在初期呈圆形，仅轻微贴壁，其细胞膜突起可感知环境并与基质接触。随着所谓新生黏附（nascent adhesions）的形成，细胞与基质之间的黏附迅速增强。随着时间推移，黏附复合物逐渐增大并成熟为局灶性黏附（focal adhesions）。

这些细长的结构主要出现在细胞周边。这是由于肌动球蛋白纤维施加的力，促使细胞基质黏附增强以及肌动蛋白纤维发生束化所致。同时，随着肌动蛋白网络的形成，细胞也变得扁平。

采集速度取决于以下参数：时间间隔、曝光时间、z轴平面数和位置数。因此，为实现高采集速率，优化这些参数至关重要。最新转盘技术的实现将使转盘式TIRF显微镜发展成为一种新型的超分辨率显微技术，从而实现高时间分辨率的成像。

转盘显微镜是一种研究细胞内部与细胞膜之间发生过程的强有力技术。我们已经证明，可以通过在几秒内获取非常大的图像序列来追踪囊泡的动态变化。准直激光对眼睛有害。

切勿直接注视光束，并使用仪器的安全防护措施以避免直接暴露于光线中。