基于结构化照明显微镜数据的时空图像相关光谱法量化T细胞中的皮层肌动蛋白流

本实验的总体目标是通过全内反射、结构化照明显微成像或湍流模拟（turf sim）获取图像后，利用图像相关光谱法对皮层肌动蛋白的动力学进行定量分析。该方法有助于解答生物物理学领域中的关键问题，例如皮层肌动蛋白流动在调控免疫突触相互作用中所起的作用。该技术的主要优势在于，它将纳米级分辨率与活细胞兼容性相结合，使得相较于传统的瞬时显微成像技术，能够观察和分析更小尺度的生物学过程。

为演示该技术，将由我实验室的博士生 George Ashdown 进行操作。取五微升直径为 100 纳米的亚衍射荧光微球储备液，滴加到新鲜未包被的盖玻片表面作为测试样品。然后用移液器吸头将微球溶液在盖玻片上铺开，并使其自然干燥。

向检测盖玻片中加入 200 微升封片介质，以准备成像。打开 turf SIM 系统载物台加热器的培养箱，并向储水槽中加入蒸馏水，完全覆盖加热元件底部。使水温平衡至 37 摄氏度。将加热套环连接至物镜，并将其设定为 37 摄氏度。

然后将与草坪 4 88 兼容的渐变块固定在显微镜的光路中，以确保正确光路被启用。将激光床的通道模式切换至单通道位置。对显微镜载物台上的光纤电缆重复此操作。

如果未执行这些步骤，软件窗口中将出现错误提示。设置好模式后，将物镜降至最低的Z平面，并在其上滴加一滴油。将带有荧光微球的待测样品盖玻片放置在显微镜载物台上。

然后在显微镜主体上选择完美的聚焦系统（Perfect Focus System，PFS）功能。逐渐将物镜沿Z轴平面上移，当PFS按钮停止闪烁时停止，这表示控制软件已到达焦平面。切换至实时成像模式，在屏幕上观察微球。

使用PFS微操作轮进行精细调焦。观察照明是否均匀，确保在75纳米气味波上方无失焦的荧光信号。最后，通过观察用于T细胞刺激的八孔腔室中荧光微球样品呈现的波动照明模式，确认已实现结构化照明。

在盖玻片上加入200微升抗CD3和抗CD28抗体混合液，37摄氏度孵育2小时。按照文本方案所述清洗盖玻片后，将其置于显微镜载物台上，找到焦平面。接着，轻轻将200微升转染的T细胞加入盖玻片上的一个孔中。

使用落射荧光追踪转染了GFP-肌动蛋白的细胞在盖玻片上的着陆过程。待细胞沉降后，使用N SimPad切换至活细胞成像模式，并检查显示器上的细胞是否处于焦点。要记录时间序列，打开ND采集窗口并选择时间选项卡。

然后点击“添加”并设置间隔为无延迟，持续时间设为10分钟。最后，在ND采集窗口中选择“立即运行”以开始记录数据。

首先打开包含正确分析模块的分析软件以重建图像。点击应用程序，然后选择显示 end sim 窗口。将照明调制对比度和高分辨率噪声抑制均设置为1，并重建 turf SIM 数据集，以从图像状态栏生成完整的 SIM 图像。

确认像素大小为 30 纳米，然后将数据导出为用于纤丝分析的 TIF 文件。下载并解压纤丝 MATLAB 软件包后，打开脚本，然后根据文本方案中所述定义不可移动去除滤波器的输入参数。

在第23行，将滤波参数设置为移动平均；在第24行，使用21作为移动平均参数，以生成一个矢量图。在第31行，将时间子区域设置为本例中的最大帧数，即63。然后在第32行，将时间偏移设置为1，范围涵盖第33至第35行。

输入输出文件的名称、输出矢量图的标题以及输出目录路径。然后定义矢量图图像的保存格式。本例中为 png。

在 MATLAB 编辑器窗口中，打开该脚本。运行“单通道小棒”程序，并执行脚本的第 1 至 23 行以加载图像序列。接着，执行“单通道小棒”程序的第 29 至 35 行。

开始进行纤毛分析时，请按照提示选择一个多边形以定义感兴趣区域（ROI），如有需要。要显示矢量图，请运行第38至52行代码。然后运行第53至72行代码以绘制此处所示的速度大小直方图，该图来自一个表达GFP标记的F肌动蛋白的OT T细胞，该细胞使用turf sim方案进行成像。

在将该细胞置于涂有抗CD3和抗CD28抗体的盖玻片上以刺激免疫突触形成的五分钟之后，文中对此进行了讨论。随后对该过程进行了时间序列成像，以可视化F-肌动蛋白的分子流动。利用Sticks程序对这些数据进行后续分析，实现了对F-肌动蛋白分子流动的定量，如左侧细胞框选区域对应的矢量图所示，该区域代表免疫突触周边的一部分。

对该图谱及 T 细胞亚区进行进一步放大，可明确肌动蛋白流动的方向性和速度，这些信息可通过矢量长度以及颜色编码来确定。速度数据还可绘制为直方图，以便进行统计分析。综合这些结果表明，在免疫突触中，F-肌动蛋白以对称的方式从周边向细胞中心流动。观看本视频后，您应能够较好地掌握如何获取时间序列图像数据，并利用图像相关光谱法分析皮层肌动蛋白动态变化。

尽管该方法可用于深入了解T细胞迁移过程中的肌动蛋白流动，也可应用于其他认为分子流动具有重要作用的体系，例如细胞迁移研究。