用于解耦机械转导信号影响的羟基-PAAm水凝胶的制备

本实验的总体目标是建立一种简单高效的策略，将任意目标蛋白固定在聚丙烯酰胺水凝胶上，从而独立调控细胞微环境的多种参数。该方法首先将蛋白溶液均匀涂布于PDMS印章表面，第二步是使用高纯度氮气稳定气流，小心干燥PDMS印章的结构化表面。

接下来，将蛋白质包被的印章以其结构化表面接触干燥的水凝胶表面，并在PDMS印章顶部施加短暂的压力点，以确保印章的微结构特征与水凝胶表面充分接触。最后一步是轻轻将PDMS印章从水凝胶表面取下，并在非打印区域去除后清洗印章。使用BSA后，细胞可附着于微图案化的水凝胶表面。最终，采用倒置荧光显微镜观察蛋白质微结构特征。

该方法有助于解答机械转导领域中的关键问题，例如细胞外基质特性（如刚度、细胞配体密度或蛋白质性质）的相对贡献。在进行该操作过程中，建议在化学通风橱中进行。首先，将直径为25毫米的圆形玻璃盖玻片放入培养皿中，并在其表面涂抹0.1摩尔的氢氧化钠溶液，持续五分钟。

移除氢氧化钠溶液，将盖玻片完全浸入无菌的双蒸水中，在摇床上轻轻摇动20分钟。倒掉无菌的双蒸水，加入更多无菌的双蒸水以完全浸没盖玻片，再轻轻摇动20分钟。用无菌镊子取出盖玻片，放入新的培养皿中。将活化面向上，用稳定的高纯度氮气流吹干盖玻片。

盖玻片干燥后，将其放回无菌培养罩中，在每张盖玻片的活化面均匀涂布一层薄薄的三甲基丙基丙烯酸酯，作用一小时。一小时后，用无菌去离子水充分清洗玻璃盖玻片。

然后将盖玻片浸入新培养皿中的无菌 DD H₂O 中。用封口膜密封培养皿，并将其置于摇床上，轻轻振荡 10 分钟。最后，使用尖端精细的无菌镊子将盖玻片从 DDH₂O 转移至新的培养皿中。

将活化面朝上，用铝箔覆盖培养皿，以防止灰尘粘附到盖玻片上，并在室温干燥处保存。开始此操作前，准备5 mL无菌的羟基聚丙烯酰胺水凝胶溶液和100 μL新鲜的10%过硫酸铵溶液。

如实验方案所述，向羟基聚丙烯酰胺水凝胶溶液中加入2.5 µL四甲撑二胺和25 µL过硫酸铵溶液。为启动聚合反应，在无菌操作台内无菌条件下，通过连续三次移液混匀溶液，避免引入气泡；取25 µL羟基聚丙烯酰胺水凝胶溶液滴加至直径为25 mm的圆形盖玻片上，立即在其液滴上方覆盖一片直径为22 mm的圆形玻璃盖玻片，以压平羟基聚丙烯酰胺水凝胶溶液。该22 mm玻璃盖玻片此前已通过在紫外臭氧清洗仪中照射7分钟进行活化处理。

用无菌镊子将玻璃盖玻片居中放置，并排除所有气泡。将羟基聚丙烯酰胺水凝胶在室温下静置聚合15分钟。手动倒置试管中剩余的羟基聚丙烯酰胺水凝胶溶液。

为监测聚合过程的完成情况，将盖玻片完全浸入无菌的 DDH₂O 中。用剃刀刀片的边缘插入 22 毫米玻璃盖玻片与羟基聚丙烯酰胺水凝胶层之间，小心地将 22 毫米玻璃盖玻片分离。用无菌 PBS 洗涤羟基聚丙烯酰胺水凝胶三次，并将凝胶完全浸没于无菌 PBS 中以保持其水合状态。

本实验中所用的聚二甲基硅氧烷（PDMS）微印章的制备方法如文本方案所述。将PDMS微印章置于体积比50:50的乙醇水溶液中，超声处理15分钟。用氮气流吹干印章，并将其图案面朝上放入紫外臭氧清洗仪中处理7分钟。

在无菌操作台中，将150微升所需蛋白质溶液滴加到A-P-D-M-S的微结构表面。本演示中使用Stamp FI nin。用无菌移液器吸头将蛋白质溶液从中心向 Stamp 的每个角落移动，使其均匀覆盖 Stamp 表面。

将蛋白溶液在PDMS印章上孵育60分钟。在此无菌操作台内，关闭灯源以避免蛋白质受损。接着，将涂有羟基聚丙烯酰胺水凝胶的盖玻片转移至新的培养皿中。

在无菌条件下，用低氮气流去除羟基聚丙烯酰胺水凝胶基质表面多余的 PBS。当观察到凝胶表面无残留水分时，停止操作。

此时凝胶不应完全干燥。使用稳定气流的高纯度氮气小心吹干PDMS印章的结构化表面。用敷料镊子夹住已包被蛋白的印章，将结构化表面与干燥的水凝胶表面接触。

使用镊子尖端在PDMS印章顶部施加短暂的压力点，以确保印章的微结构与水凝胶表面充分接触。室温下将PDMS印章留在水凝胶表面一小时后，用敷料镊子轻轻将PDMS印章从羟基聚丙烯酰胺水凝胶上取下，并将其在乙醇水溶液中振荡清洗15分钟以清洁印章。在无菌条件下，通过三次更换PBS溶液对印迹后的羟基聚丙烯酰胺水凝胶进行充分洗涤，每次更换间隔10分钟。

最后一次 PBS 洗涤后，加入无菌的 BSA 溶液，在摇床平台上于 4 摄氏度下轻轻振荡孵育过夜。这将在次日阻断非打印区域。在无菌条件下，通过三次更换 PBS 对 stamped hydroxy poly acrylamide 水凝胶进行充分洗涤，每次更换 PBS 洗涤 10 分钟。

经压印的羟基聚丙烯酰胺水凝胶可在4摄氏度下保存长达一周。结果显示，羟基聚丙烯酰胺水凝胶的刚度演变与双丙烯酰胺交联剂的用量之间存在线性相关性。在三种不同刚度的羟基聚丙烯酰胺水凝胶上沉积的层状矩形微图案的落射荧光图像，展示了微图案几何形状与基质刚度的独立调控。通过调整用于孵育PDMS印章的蛋白溶液浓度，可调节细胞配体密度。

图中显示了两次连续微接触印刷的荧光图像。红色为纤连蛋白条带，绿色为层粘连蛋白条带，二者以90度交叉排列，并在25千帕的羟基聚丙烯酰胺水凝胶基底上依次微印刷了纤维蛋白层粘连蛋白和胶原蛋白条带。当原代细胞接种于均匀包被和微图案化的羟基聚丙烯酰胺水凝胶表面时，细胞活力在接种后三天内至少保持80%。

还观察到，与软基质相比，细胞在较硬的基质上增殖更明显。当将细胞接种于三种不同硬度的羟基聚丙烯酰胺水凝胶上、并以矩形纤连蛋白包被的微图案进行培养时，原代内皮细胞在软基质上表现出较低的肌动蛋白纤维密度和圆形的细胞核。

在较硬的基质上，肌动蛋白纤维更直且更粗，细胞核在其发育后发生形变。该技术为机械转导领域的研究人员探索细胞微环境参数在多种细胞系统（如原代细胞或干细胞、组织水平、模式生物、种群特征或器官系统）中的独立作用奠定了基础。