电离辐射后γH2AX空间分布的评估

大家好，我是 Raja Ti，目前正在贝克IDI心脏与糖尿病研究所攻读博士学位。我将为您演示在新生心肌细胞中进行三维成像以观察DNA损伤及染色质凝聚的东方修饰标记的具体步骤。DNA缠绕在核小体周围。

每个核小体由四种不同类型的组蛋白组成，即 H2A、H2B、H3 和 H4。DNA 断裂的形成会通过 H2AX 的磷酸化（γH2AX）进行标记。这种 H2AX 的磷酸化主要发生在富含组蛋白 H3 第4位赖氨酸甲基化（H3K4me）的区域。接下来，我们将观察细胞中经 γH2AX 和甲基化的 H3K4 免疫标记的三维修饰示意图。

我们开始吧。首先，将细胞悬液的 E 份加入 15 mL Falcon 管中，用 PBS 洗涤两次，每次在 150 ×g 条件下离心，然后重悬。

用新鲜培养基重悬细胞，以观察辐射对细胞事件的即时影响。在辐射前及辐射过程中，将细胞置于视野中观察5至10分钟。对细胞进行γ射线或X射线照射后，将三毫升细胞悬液分别加入六个GU中。

将细胞在37摄氏度下孵育30分钟至1小时，使用微孔板检测γH2AX峰值。我们使用Cytospin将非贴壁细胞沉降到玻璃载片上。组装Cytospin离心管时，确保滤膜完全对准漏斗。

加入50微升，用拭子将该细胞悬液转移至每个胞嘧啶最终位置，将胞嘧啶夹放入胞嘧啶装置中，以500转/分钟离心5分钟。取出胞嘧啶夹，将载玻片从滤纸卡上分离。切勿让细胞干燥过久，以免影响荧光素染色的背景。

使用防液体扩散笔在每个涂片区周围画圈，随后在室温下用4%多聚甲醛固定细胞5分钟。与乙醇或甲醇相比，使用4%多聚甲醛固定效果更佳。接着将载玻片用含Triton X-100的PBS在室温下孵育5分钟以通透细胞。

与使用Triton X-100处理的细胞相比，我们观察到信号有所增强。每次用PP S洗涤细胞3次，每次5分钟。用BSA在室温下封闭细胞10分钟，并与其他封闭剂及封闭时间相比，重复此步骤3次。

在减少一抗的非特异性结合方面，BSA 效果最佳。我们使用两种一抗，均用含 1% BSA 的溶液以 1:500 的比例稀释，每张切片大约加入 50 微升一抗溶液。室温孵育一抗 60 分钟，相较于 4 摄氏度过夜孵育，可降低背景染色。用 PBS 洗涤细胞三次，每次五分钟。

Alexa floor 4 88，具有良好的抗小鼠特性，Alexa floor 5 46 具有抗兔特性。使用二抗以同时标记不同的标志物。应使用在不同物种中产生的抗体。

每个载玻片上加入约 50 µL 稀释的二抗。将细胞在室温下孵育 90 分钟。建议将细胞置于湿盒中孵育，以防止细胞和抗体干燥。用 PBS 洗涤载玻片，每次 5 分钟，共洗 3 次。

向每张载玻片加入50 µL以PBS配制的1:500稀释的topo three溶液。用PBS洗涤载玻片，每次5分钟，共洗涤三次。去除载玻片上多余的水分，然后加入Antifa溶液。

添加抗荧光淬灭剂溶液前，不建议将细胞完全干燥。将盖玻片置于载玻片上时，应注意避免产生气泡。

将载玻片置于黑暗湿润的孵育盒中过夜。用指甲油封片，以防止细胞干燥。在共聚焦显微镜下获取的图像显示。

更高的空间分辨率已经实现，图像采集采用氦激光器。优先选用63倍油镜物镜，而非更高或更低放大倍数的物镜。将缩放倍数设为三到四倍可获得分辨率更佳的图像。

对于大量细胞的荧光定量分析，建议使用八倍扫描速度，图像尺寸设置为1024×1024像素。进行多通道成像时，推荐采用逐行顺序扫描，而非帧扫描。为避免样品发生光漂白，应调整检测器增益和放大器偏移，以降低背景噪声和信号饱和。

由于 Kama HX X 四的尺寸可能小于 0.5 微米，建议沿喷流轴方向以至少 0.5 微米的步长采集图像，喷流系列图像需采用“mark first”和“mark lost”模式。为展示不同蛋白质之间的空间关系，建议使用 Metamor 第一，扫描速度设为 6，图像尺寸设为 2048 × 248 像素。

可以从不同共聚焦显微镜获取的图像中计数秒。通过文件菜单直接打开 gamma hgx 图像标签，或使用票据编号打开标签。转到“处理”菜单并选择“图像栈算术”。

选择最大投影并选取要包含的层面，然后单击确定。接着选择顶帽变换，并将Gamma H2X图像作为源图像进行应用。

顶部帽状滤波器及其生成的图像将是一个噪声较少且焦点强度变化降低的二值图像。进入“区域”菜单，选择区域绘制工具，并在细胞核周围绘制区域。进入“处理”菜单，选择阈值化图像。

选择包含阈值并设置较低和较高的阈值数值。通常，正是这些阈值数值会影响四项数值。最佳阈值应尽可能减少背景的包含，同时最大化目标区域的包含。

通过使用不同的阈值来统计菌丝侵染数量，可最佳实现此目的。然后将菌丝侵染数量与肉眼计数结果进行比较。选择DPI图像，进入区域菜单，选择转移区域选项。

现在我们已准备好用于计数的对应菌丝体和细胞核图像。大多数细胞核区域已转移至top hat。转到“测量”菜单，选择“整合分析”（IMA），选择“测量所有区域”，然后点击“测量”以获得FTE数值。

现在可以使用日志数据选项将各区域的FTE数值导出到电子表格中。打开先前为每个通道创建的喷射投影图像。转到显示界面并选择颜色对齐。

选择每个通道对应的源图像，以创建三个通道的合并图像。通过线扫描分析来展示不同标记物在细胞核内的空间定位。前往测量工具栏命令，选择线扫描分析，并在细胞上画一条直线。

这将生成一条曲线图，显示各通道沿该线的荧光强度，并表示不同标记物之间的相对距离。要从图像序列创建三维图像，请进入图像序列菜单并选择三维重建，然后选择最大值投影的三维重建类型。

选择旋转平面，选择射流校准距离。通常用户指定后点击“确定”以生成三维重建图像。至此，我们完成了免疫荧光染色及图像分析的实验方案。

总之，免疫荧光共聚焦显微镜是一种用于观察细胞核内不同C标记物和γH2AX的三维可视化技术。感谢观看。