进行定制化 microRNA 芯片实验

本实验的总体目标是进行 micro RNA 微阵列实验。首先获取含有 micro RNA 探针文库的打印微阵列芯片，并制备质量和数量合适的 RNA 样本。随后，将 RNA 与受控的 DNA 样本用荧光染料进行标记。

然后将标记的核酸加入微阵列芯片中进行杂交。最后，对微阵列芯片进行洗涤、扫描，并实现芯片的再生。最终，通过分析芯片上各个微小RNA探针的杂交信号强度，可以获得显示微小RNA全基因组表达水平的结果。

该方法有助于回答基因表达领域中的关键问题，例如正常生理条件或病理条件如何在全基因组范围内差异性地影响微表达需求。微阵列制备的质量是微阵列实验成功最关键的要素之一。在采用可保留小RNA的方法提取RNA，并将其重悬于浓度等于或高于2毫克/毫升的溶液后，可在20微升反应体系中对RNA进行标记：首先将约25微克总RNA与0.5微克的5′-P-C-U-D-Y 5 4 7-3′在1× HEPs缓冲液中混合，该缓冲液需添加T4 RNA连接酶1、DTT和ATP。若RNA用量较少，可相应减少RNA用量及反应体系。

如果RNA浓度极低，可加入酵母tRNA等载体以帮助沉淀，将反应置于冰箱中冰上孵育2至24小时。接着加入乙酸钠至终浓度为0.3摩尔，再加入三倍体积的乙醇，并在-20摄氏度下沉淀RNA过夜。首次使用载玻片时，需在含有3×SSC、0.1% SDS和0.2% BSA的过滤溶液中于37摄氏度预杂交30至60分钟。

接下来，将载玻片浸入水中数次，然后放入异丙醇中，使用带有载玻片适配器的离心机，在22°C条件下以100 × g离心5分钟，干燥载玻片。用水冲洗升降条。

然后在空气中干燥前用乙醇处理，将一张载玻片放入微阵列杂交室底座内，并在载玻片上方放置一张盖升片，使盖升片覆盖探针区域及其白色条带。避光孵育，离心沉淀标记的RNA，用70%乙醇洗涤一次，并将沉淀物空气干燥。沉淀物应呈微红色。

使用纯化的标记参考 DNA，按每份 RNA 样品加入其体积的十五分之一至一百分之一的比例配制杂交溶液。用约 60 微升杂交溶液完全溶解 RNA 沉淀，以确保杂交溶液不会干涸。在孵育过程中，向杂交腔底部的每个加湿孔中各加入 20 微升水。

将标记的 RNA 与参考 DNA 的混合物加入到载玻片上。使用细的移液枪头轻轻接触盖玻片的边缘，并通过毛细作用使溶液进入盖玻片与载玻片之间的空间。

将杂交室盖子盖在底座上，然后用金属夹密封杂交室。将整个杂交室放入随附的塑料袋中。

最后，将腔室盒放入装有湿纸巾的容器中，用保鲜膜覆盖容器，并置于37摄氏度的湿润细胞培养孵育箱中约24小时。杂交完成后处理玻片时，依次拆卸腔室盒，将一张玻片及其载片架浸入22摄氏度的2×SSC溶液中。

提升器滑片将自然从载玻片上脱落，用0.8 XSSC缓冲液将载玻片洗涤两次，再用0.4 XSSC缓冲液洗涤三次，总时长为一至两分钟。使用配有载玻片适配器的离心机将载玻片干燥。随后，用微阵列扫描仪扫描载玻片，并使用诸如blue fuse之类的软件对图像文件中的信号强度进行定量分析。

在杂交后，检查各个点样以排除异常点，这些异常点通常由点样板打印或玻片操作引起。进行数据分析和展示时，可使用如 Gene Spring 和 Excel 等软件对微阵列数据进行再分析。将玻片先用水冲洗，然后浸入预热的染色缸中，内含 1 mM NaOH 和 0.1×SSC 溶液，62 °C 下处理 10 至 20 分钟以剥离探针。

再次重复孵育一次。在22摄氏度下，用去离子水轻轻振荡洗涤载玻片数次，总时长不超过60分钟。使用离心机干燥载玻片，并于22摄氏度保存。

载玻片无需预杂交即可使用。该图显示了一个微阵列的扫描图像，展示了非常精确且强烈的杂交信号。红色斑点来自参考DNA的杂交，绿色斑点来自DY 547标记的RNA样本，黄色斑点则是DNA和RNA同时与同一探针杂交的结果。

技术重复的微阵列杂交之间的皮尔逊相关系数约为 0.99，表明重复性极佳。观看本视频后，您应能充分理解如何开展定制的微阵列实验，不仅可用于定量微小核酸酶，也可用于定量其他类型的核酸，如 mRNA。