大规模基于斑马鱼的体内小分子筛选

以下实验的总体目标是发现能够特异性调控胚胎发育和生理关键环节的小分子。该目标通过将大量受精卵放入96孔筛选板中来实现，这是第二步操作。随后，将小分子文库的等分试样加入到96孔板中的胚胎内。

通过培养板检测小分子诱导的表型。获得的结果可显示哪些小分子特异性影响超级鱼的发育或生理。您好，我是范德堡大学医学院的 Charles Hong。

在我们的实验室中，我们使用斑马鱼胚胎进行高通量化学筛选。这是一种相对简单且可广泛适用的技术，可用于发现新的生物活性化合物。在进行化学筛选的前一天下午，设置10至20个斑马鱼繁殖缸。

在每个水箱中放入一个隔离板，使用渔网从养殖系统中取水并转移一条成年雄鱼和一至两条成年雌鱼至内层容器中。在每个繁殖水箱上做好标签，并在筛选当天早晨加盖。移除繁殖水箱中的隔离板，让斑马鱼进行交配。

在接下来的一个小时内，让受精卵通过每个内容器底部的网格落下。一小时后，将成年斑马鱼放回永久性储存水箱中。

取出内层容器，将每个繁殖罐中的水通过塑料茶漏过滤，收集卵。将茶漏倒置在培养皿上方，轻轻冲洗茶漏，使卵冲入培养皿中。使用装有E3培养基的洗瓶，去除所有呈不透明状的未受精卵。

使用一次性塑料移液管，每次交配杂交应获得约 200 个胚胎。然后用玻璃巴斯德移液管将约五个胚胎转移至含有 E3 培养基的 96 孔板的每个孔中。一旦胚胎被排列至 96 孔板上。

使用12通道移液器尽可能吸出孔中的E three培养基，注意不要刺破胚胎。使用12通道移液器加入250 µL的E three培养基。

尽快向每个孔中加入含有 0.5 微克/毫升卡那霉素的培养基，以防止胚胎干燥。将 96 孔板放入 28.5 摄氏度的培养箱中，直至胚胎发育至需要添加化合物的特定阶段。在本实验方案中，我们寻找能够干扰早期胚胎模式形成的化合物，因此将胚胎孵育三小时，或直至超过 90% 的胚胎达到 1000 细胞期，此时通常提供小分子文库。

在96孔源板中，每种化合物以DMSO配制的10毫摩尔浓度储备液形式储存，在胚胎达到所需阶段前约60分钟，取出适量含有小分子分装液的96孔板进行解冻。记录源板的序列号或其他识别编号，以尽量减少孔板上的冷凝现象。将板放入含有干燥剂的干燥室中。

将微孔板放入配备多孔板转子的台式离心机中短暂离心。使用12通道移液器从源板上移除铝制封膜，并用DMSO将源板中的化合物稀释至所需浓度。在本方案中，我们使用0.5毫摩尔的终浓度，向10毫摩尔的母液板中加入4.75微升DMSO进行稀释。

当96孔板中的胚胎发育至所需阶段时，使用12通道移液器将2.5微升化合物从源板转移至含有胚胎的受体板中。用盖子盖好现含有胚胎和化合物的板，并在胚胎板上记录源板的编号。轻轻摇晃混匀后，将板置于28.5°C的培养箱中。

将含有未使用小分子的每块源板用铝箔封盖，再用胶带密封，并置于–80 °C冰箱中长期保存。在进行视觉筛选之前，需制定明确的阳性命中标准。例如，在针对四个小分子抑制剂影响脑发育的筛选中，阳性命中可能是指导致前脑缺失的化合物。

眼睛缺失是前脑发育缺失的一个直观视觉指标，可在发育过程中的指定时间点通过肉眼观察进行检测，无需荧光标记。从培养箱中取出含有化合物处理胚胎的96孔板，在筛选抑制前脑发育的小分子抑制剂时，使用体视显微镜检查每个孔；为观察眼睛缺失作为前脑发育受抑制的标志，应在处理28小时后进行观察。记录其中至少五个胚胎中有三个或以上表现出规定表型的孔所在的96孔板编号及孔位位置。将96孔板放回培养箱中继续培养。

在48小时时再次确认眼睛和前脑的缺失。尽管胚胎将没有前脑，但它们仍可存活至少四天。通过在多个剂量下重复测试化合物的作用来重新确认潜在的有效结果，每个剂量使用48孔板格式，在0.5毫升E3培养基中测试10个胚胎。

重新测试化合物时，加样时间应与原始筛选时完全相同。当化合物在重新测试中以剂量依赖性方式重现所诱导的表型时，即可确认为高诱导性化合物（HIIT）。最后，从化学文库的小分子数据库中鉴定出高诱导性（hi）化合物。

利用基于斑马鱼的可视化化学筛选，我们发现了一种小分子 Hedgehog 信号通路抑制剂，其作用依据是其对体轴的影响。该图像显示了暴露于 Hedgehog 抑制剂的胚胎，其尾部出现明显的腹侧弯曲。在 24 小时时，与 48 小时观察的相同胚胎相比，仍表现出腹侧弯曲的表型。

该图像显示了经化合物处理的胚胎与刺猬信号通路突变体胚胎的对比。掌握该技术后，一人每周仅需数小时即可筛选约400种化合物。该技术还为化学生物学家研究细胞发育、细胞信号通路以及胚胎发育等过程开辟了道路。

在处理未表征的小分子时，必须注意安全，穿戴实验服和手套，因为这些未表征的分子可能具有潜在危害性。