高通量研究体系的建立与优化 表皮葡萄球菌 和 Mycobacterium marinum 感染作为药物发现的模型

本实验的总体目标是生成大量感染的斑马鱼胚胎，用于高通量化合物筛选，从而推动药物发现。首先使用大型繁殖装置，在单次操作中获得大量同步发育的斑马鱼卵；随后将鱼卵排列至aros网格中，并利用自动化显微注射仪将细菌注入卵黄，实现感染。

当感染在胚胎中扩散后，先通过大颗粒流式细胞术对胚胎进行预分选，然后再进行药物处理。最后，在化合物处理后分析感染胚胎中的细菌负荷水平。最终，通过共聚焦显微镜对脊椎进行高分辨率分析。

采用自动化筛选和大颗粒取样技术，可以更详细地展示化合物对感染的影响。与现有的手动注射或PIX扫描分析等技术相比，该方法的主要优势在于能够生成大量均一受感染的胚胎，并以高通量的方式进行分析。制备表皮葡萄球菌（S. epidermidis）接种物时，从含有A PW VW 180 9衍生的M cherry表达载体的S. epidermidis菌株O 47平板上挑取多个单菌落，并进行接种。

取25毫升LB培养基，添加10微克/毫升氯霉素，37摄氏度过夜培养至次日对数中期。取1毫升菌液在12,000 × g离心1分钟，用含0.3%（体积/体积）吐温80的无菌PBS洗涤菌体沉淀三次。测定OD600光密度值，并使用PBS配制的2%（重量/体积）聚乙烯吡咯烷酮40（PVP 40）将细菌悬液稀释至OD600为0.3，相当于1×10⁸ CFU/毫升。

为制备分枝杆菌接种物，从稳定表达PS MT 3M樱桃载体的M Meum菌株M或E 11的Middlebrook 7H10培养基上挑取数个单菌落，接种于10毫升含10%（体积比）Middlebrook ADC增菌液的Middlebrook 7H9液体培养基中，并添加50微克/毫升潮霉素，于28摄氏度振荡培养过夜。次日，取1毫升培养物在12,000 ×g离心1分钟，弃上清，用1毫升含0.3%（体积比）吐温-80的无菌PBS重悬菌体，洗涤菌体沉淀三次。

测量细菌悬液在600 nm处的光密度（OD 600），并用含2%（重量/体积）PVP 40的PBS缓冲液稀释至OD 600为0.3，相当于每毫升0.3 × 10⁸ CFU。为获取斑马鱼卵，在收集前一晚，将最多50条雌性斑马鱼放入大型繁殖容器的底部区域，70条雄性斑马鱼放入容器上部区域。次日早晨，从容器中移除隔离板，约一小时后，通过繁殖容器底部的卵收集器将卵收集至含有卵水的50毫升离心管中。

制备注射板后，根据自动显微注射仪操作软件中的文本方案，先点击“校准载物台”，然后选择“10 24孔板网格”，将 aros 板放入显微注射仪中，通过在屏幕上的孔中心位置点击来校准板位。随后进入针头菜单，点击校准针头夹持器。

使用微量加样器吸头，将10微米直径的注射针填充10微升含PVP 40的溶液，其中包含每纳升100个菌落形成单位（CFU）的表皮葡萄球菌（S. epiderm）、每纳升30个CFU的erum，或仅含PVP 40用于模拟注射。将注射针放入自动显微注射仪中，通过降低或升高针头并在屏幕上点击针头所在位置，校准其XY位置。然后通过在屏幕上点击针尖位置，校准针头的Z轴位置。接下来，使用塑料移液管将卵分布至aros网格上，并去除多余的卵水。

然后将装有卵的agros网格放入自动显微注射仪的注射菜单中，将注射压力调整为200百帕，注射时间调整为0.2秒，补偿压力调整为15百帕，该参数在Femto jet设置菜单中对应1纳升。点击“全部注射”，对整板胚胎进行注射。注射后，用培养皿清洗卵并收集，于28°C条件下孵育。

大型颗粒流式细胞仪设置完成后，进入PMT菜单，将红色通道设为650伏，绿色和黄色通道设为0伏。然后在阈值菜单中，将光密度阈值信号设为50（对应975毫伏），飞行时间最小值设为800（对应320微秒）。为减少碎片干扰，将胚胎放入样品杯中，并在分选菜单中设置每孔板最多分选70个胚胎，输入70以设定最大值。

将一个空的培养皿放在分选仪下方，然后点击手动分选。当培养皿装满后，通过点击存储来保存数据。如果需要高分辨率分析或成像，可将胚胎 individually 分选至 96 孔板的各个孔中。

将胚胎放入样品杯中，并设定每个孔最多分选一个胚胎。然后将一个空的96孔板放入左侧的板架中，点击“填充板”。当板填充完成后，通过点击“存储”保存数据，以便在注射后三天使用erum分析药物处理的胚胎。

将一组胚胎用溶剂中的待测化合物处理，另一组仅用溶剂处理。将处理后的胚胎在受精后第4天和第5天放入流式细胞仪的样品杯中，在用三卡因麻醉胚胎后，设置脊椎动物自动筛选系统和大颗粒采样器，并将分选设定为每孔板70个胚胎。根据成像目标检测设置菜单中的文本方案，在成像自动存储图像菜单中选择与胚胎年龄对应的标准图像，选择要生成的图片数量及使用的方向。

将装有胚胎的96孔板放入大颗粒采样器左侧的板架中，然后点击运行板。当胚胎位置正确后，使用10倍明场干镜分别对头部和尾部进行成像。然后使用图像处理软件将图像拼接在一起，以评估最适合卵黄感染的发育阶段。

在1细胞期至512细胞期之间的各个不同阶段均进行了海分枝杆菌和臼的注射。如图所示，在16细胞期至128细胞期之间注射100 CFU的海分枝杆菌可获得最佳感染模式。细菌在卵黄内增殖达三天，并从感染后第三天开始扩散至胚胎体内。

通过使用大颗粒流式细胞仪进行荧光强度分析，实现了对细菌载量的高通量定量。如图所示，胚胎内存在的活菌数量与所测得的荧光信号高度一致。该结果表明，对于E 11菌株，在16至128细胞阶段之间注射30 CFU的aminum为最佳发育时期，而对于另一菌株则为16至64细胞阶段之间。

在这些阶段注射毒力更强的EM菌株后，胚胎内出现细菌在卵黄内的生长，并且细菌在胚胎中扩散。经不同浓度利福平预处理感染爱民菌的胚胎后，分枝杆菌感染程度呈剂量依赖性降低。使用200微摩尔浓度的药物表明，该药物在处理后24小时及之后能有效抑制M. mein E11的细菌进展。

这些技术为致力于化合物筛选和药物开发的研究人员铺平了道路，有助于寻找结核病或与生物材料相关感染等传染性疾病的新疗法。