使用转基因 C. elegans 模型检测β-淀粉样蛋白毒性

以下实验的总体目标是在活体模型系统中检测β-淀粉样蛋白肽的毒性。该检测方法具有可重复性强和相对简便的特点，可快速测试药物、环境条件或遗传修饰对β-淀粉样蛋白毒性的影响。建立该检测方法的关键在于构建转基因秀丽隐杆线虫，使其在肌肉组织中温度诱导特异性表达β-淀粉样蛋白肽。

这种温度敏感性表达是通过构建一个包含异常长的3'非翻译区的转基因来实现的，该3'非翻译区使转基因mRNA成为mRNA监控系统的靶标。因此，在具有功能性mRNA监控系统的野生型线虫中，由于转基因mRNA被降解，其表达水平较低。如果将该转基因引入到mRNA监控系统关键组分存在突变的遗传背景中，则转基因的表达水平将显著升高。若该遗传背景在mRNA监控系统中含有温度敏感性突变，则在非允许温度下培养该转基因品系时，可阻断转基因mRNA的降解，从而导致高水平的转基因表达。利用该系统调控体壁肌中β-淀粉样蛋白肽表达的转基因线虫，当温度从16摄氏度升高至25摄氏度时，会导致β-淀粉样蛋白肽大量积累、肌肉细胞功能障碍以及线虫瘫痪。对该过程的时间进行测量。

需要一定数量的这种产沟道蠕虫在温度升高后才会出现瘫痪现象。温度上调后的瘫痪实验是检测β-淀粉样蛋白毒性的敏感方法。为此需制备新鲜的线虫生长培养基平板用于瘫痪实验，以尽量减少可能影响瘫痪率的环境变量。

第二步，启动年龄同步的转基因线虫群体，以最大程度减少发育阶段对转基因表达的影响。随后，将同步化的三龄幼虫从16摄氏度升温至25摄氏度，以提高转基因mRNA的稳定性，并促进β-淀粉样肽的积累。通过测量每条线虫从升温到瘫痪的时间，可反映肌肉功能障碍的速率，从而评估β-淀粉样肽积累所产生的毒性效应，获得的结果可用于显示特定处理对内源性表达的β-淀粉样肽毒性的干预作用。

因此，与使用转基因小鼠模型来检测药物活性相比，我们的技术主要优势在于操作更快速，且成本显著降低。该方法的可视化演示至关重要。在麻痹检测实验中，对L4期线虫进行评分非常难以掌握。

因此，当你对一条L4期瘫痪的线虫进行评分时，需要观察的是线虫头部区域孤立的晕轮样运动。一旦观察到头部在运动而线虫整个身体处于瘫痪状态，就将该线虫记为瘫痪。瘫痪实验通常在标准线虫培养基（NGM）平板上进行，这种培养基常规用于秀丽隐杆线虫（C. elegans）的繁殖和遗传学研究。

制备平板时，将含有氯化钠、琼脂和肽的NGM溶液置于锥形瓶中进行高压灭菌，然后加入适量的以下无菌溶液，这些溶液的详细信息见随附的书面实验方案。将10毫升液态NGM分装至每个60毫米×15毫米的培养皿中。于室温下静置过夜，使NGM完全凝固。

若需检测化合物或提取物的效果，可将提取物等分试样加至每个平板上，并使用涂布棒将其均匀涂布于平板表面。将平板在室温下过夜干燥。超过一毫升的体积需要更长的干燥时间。

接下来，在每个平板上点样250微升在LB培养基中过夜培养至光密度为0.4至0.6的大肠杆菌OP50菌株，于室温下静置过夜使细菌干燥。平板的存放时间对麻痹率有显著影响，存放时间较长的平板容易干燥。平板应在进行麻痹实验前一周内制备。

理想情况下，应使用在同步产卵前 3 到 4 天制备的平板。任何实验中所用的同步产卵平板均应来自同一批次。改变菌苔的大小或细菌种类也会影响线虫的行为。麻痹实验可使用其他大肠杆菌菌株进行，例如 RNAi 实验中常用的 HT115 菌株。然而，这可能会改变麻痹实验的动力学过程。

因此，必须使用合适品系的内参对照。CL 476 是最常用于检测 β-淀粉样蛋白诱导麻痹的品系。该品系及其他转基因模型可由圣阿哈迪遗传中心以少量费用向学术研究人员提供。

为了最大程度地提高测试群体的年龄同步性，建议从经过同步化的亲代开始。在启动测试群体的麻痹实验前一周，使用铂金线虫挑取器将20至30只成年线虫转移到多个10厘米的NGM平板上。

在16摄氏度（CL4176的允许温度）下，使用OP50平板进行两小时产卵。移除亲代成虫，让子代生长七天，此时它们将发育为第二日成虫。第二日成虫。

使用成虫为每种实验条件制备年龄同步的测试种群。目的是使用铂金线虫挑取器，将10至12只产卵第二天的成年线虫转移到已接种OP50的大肠杆菌并直径为60毫米的NGM平板上，制备三个重复的平板，每个平板中含有50至75条年龄同步的线虫。将线虫在16°C条件下放置2小时，使其产卵，随后移除成虫，让卵在16°C下孵化并继续生长。

此时，最好由不参与平板评分的人员对平板进行编码，以确保评分者对实验条件保持盲态。卵子产出时的胚胎发育阶段（在最佳条件下，野生型线虫约为26细胞期）取决于成虫的年龄和营养状况。如果用于产卵的重力成虫年龄较大或处于饥饿状态，则产出的卵发育阶段会较晚，无法获得同步化的群体，从而影响麻痹实验的动力学结果。

必须使用单基因细菌培养物（如大肠杆菌 OP 50），因为任何形式的细菌污染都可能严重影响本实验。为诱导转基因并进行麻痹检测，若三个重复平板中的线虫数量相近，则实验可重复性最高。将平板转移至 25 摄氏度环境中。

同步产卵结束后48小时，线虫应发育至第三幼虫阶段。培养板应置于25摄氏度培养箱中，避免叠放，以确保培养板充分达到该温度。同时，在温度上调开始后18至20小时，开始对线虫的麻痹表型进行评分。

此时，种群中的所有线虫应已发育至第四幼虫阶段，继续以每两小时为间隔进行评分，直至每个培养皿上的所有线虫均出现麻痹。由于未知原因，麻痹现象在虫体长度方向上并不均匀，头部区域是线虫最后停止运动的部分。

因此，刚出现麻痹症状的线虫无法在培养皿上移动，但仍能摆动头部，从而清除其身体前部周围的细菌，形成一圈无菌区域（透明圈）。这些线虫最终将不可避免地完全麻痹，因此具有透明圈的线虫被判定为已麻痹。部分线虫虽无透明圈，但也未表现出自发运动。

通过使用线虫挑取工具轻触线虫进行检测。若轻触后线虫无法完成全身波浪式运动，则记为瘫痪，以实现高效评分。为避免在下一轮评分时被无意中重复评分，最简便的方法是将已瘫痪的线虫移至培养皿上无菌斑的区域。

这还能使分类错误的线虫表现出运动，从而通过评分校正生成麻痹曲线。在每个时间点，将每块培养板上未发生麻痹的线虫比例转换为百分比，并将平均未麻痹百分比对升温开始后的时间作图。所得曲线在形式上类似于生存曲线，因此可采用标准的非参数生存统计方法进行分析。

为了启动瘫痪表型，必须在转基因 myo three A beta 蠕虫发育至中期 L4 阶段前完成升温处理。myo three 启动子具有发育阶段特异性调控特性。一旦蠕虫进入晚期 L4 阶段或成虫阶段，其表达水平将显著下降。

如果线虫处于饥饿状态，外源基因的表达会被抑制，因此在整个实验过程中必须确保线虫得到充分喂养。我们从未观察到任何瘫痪的线虫在任何条件下恢复活动。在升温处理12至16小时后，CL 41 76线虫将出现瘫痪，无论是否将其转移回16摄氏度的环境中；在CL 41 76菌株中，导致瘫痪的外源基因表达上调可在较低温度下发生。

然而，请注意，麻痹发生率的时间进程会受到影响。麻痹发生率取决于所使用的特定转基因品系。我们已构建了 myo-3::Aβ 品系，其麻痹发生率快于或慢于 CL4176 品系；因此，您需要相应调整麻痹实验的观察时间窗口。

此处显示的是 CL 4 1 76 的麻痹曲线图，包括未经处理和暴露于 6.27 毫摩尔咖啡因的条件。该处理导致麻痹时间显著延迟约四小时，且具有高度统计学意义，我们将其解释为表明 β 毒性受到抑制。在此模型中，本实验检测了咖啡中另一种化合物的影响。

该曲线图是那些不影响β毒性的处理的典型表现。注意，在这两个实验中，约一半未经处理的CL 4 1 76种群在24小时时已出现瘫痪，到28小时时瘫痪达到完全。这些是对照组瘫痪的典型时间范围。

CL 4 1 7 6 种群在此时间点上的显著偏差表明环境条件发生改变或转基因拷贝发生自发性缺失。有关 CL 4 1 7 6 品系的更多信息，请参见配套的实验方案。在进行该实验操作时，需注意培养板的使用时间、线虫种群的发育阶段，以及对线虫麻痹率进行准确评分的能力。

观看本视频后，您应该能够很好地掌握如何利用这种海蜗牛系统来精确检测β-淀粉样蛋白的毒性。您将能够检测出多种环境因素或药物处理对该毒性产生的细微影响。我们讨论过的这些变量非常重要，需加以注意，因为这将使您能够高度可重复地进行检测，并获得一致的麻痹动力学结果。

如果希望比较不同时间、不同人员在本实验室获得的结果，或比较使用该模型系统的其他研究人员的结果，这一点实际上非常重要。