在 C. elegans 中测量 RAN 肽的毒性

RAN多肽是亨廷顿病、肌萎缩侧索硬化症和额颞叶痴呆等重复序列扩增性神经退行性疾病的重要特征。这些实验方案为在秀丽隐杆线虫（C.elegans）模型系统中定量评估RAN多肽的毒性提供了重要的标准化方法。所述技术易于掌握、成本低廉、操作快速，并可利用秀丽隐杆线虫系统中运动和繁殖等可重复的生物学特征。

在尝试本方案时，主要挑战在于获得稳定的RAN肽毒性和表达水平。需要控制的主要因素包括药物温度、温度变化的时间点以及检测板的制备。在这一依赖年龄的过程检测中，实验人员对动物表型进行一致分类至关重要。

该技术的可视化演示展示了其分类标准。首先，将含有1毫摩尔IPTG和25微克/毫升羧苄青霉素的标准线虫生长培养基倒入24孔板中。将RNAi诱导克隆在HT115菌株中接种于LB羧苄青霉素琼脂平板上，并在37摄氏度下培养24小时。

第二天，挑取单克隆接种于1 mL含羧苄青霉素的LB液体培养基中，于37摄氏度、250 rpm振荡培养18小时。按照文本手稿中的描述，将过夜培养的菌液各20微升分别点种到NGM RNAi 24孔板的四个独立孔中，使RNAi细菌在过夜期间诱导双链RNA的产生。采用标准次氯酸钠法，从表达整合型RAN肽转基因的C.elegans成虫第一天个体中分离卵。

然后将约30枚卵接种至24孔板的每个孔中，于20°C下孵育7天。为进行视频速度分析，使用配备单色相机的体视解剖显微镜，从每种RNAi条件下两个独立的孔中各获取两段视频。确保各孔之间的图像采集参数设置保持一致。

每段视频的持续时间设为10秒，时间间隔设为76毫秒。图像曝光时间设为4毫秒，使用1.49倍的缩放设置。然后选择2×2像素合并模式。

确认分辨率为 800 × 600 像素，然后开始录制。采集完成后，立即使用菌株、RNAi 条件和孔号对每个视频进行标记。随后，对每个视频中的 20 只不同动物测量其移动距离和体长，每种 RNAi 条件共检测约 40 只线虫。

在软件中，选择注释工具按钮，然后选择绘制文本工具。在视频第一帧中被测线虫的中心位置单击，并用一个数字标记该点。

在视觉上追踪线虫的同时，将视频推进至末尾。然后点击线虫，并用下一个相应的编号标记它。使用绘制比例尺工具，从第一个编号画一条线到第二个编号，并在电子表格中记录所移动的距离。

在视频中对另外19条线虫重复此测量过程，并在分析窗口中保留每一条线虫的个体测量数据。完成所有测量后，截取最终视频帧的快照，以显示所有测量线，确保数据可追溯至其来源个体。接下来，使用一个四列电子表格分析数据，其中第一列为线虫标识符，第二列为运动速度。

每个视频的时间可以通过在实验下方的视频上单击右键并查看属性找到。为了标准化速度测量，请测量每只动物的长度。使用绘制折线工具，自由地从秀丽隐杆线虫（C.elegans）头部尖端到尾部尖端进行描记。

然后截取最终视频帧的快照，以显示所有多段线。线条的长度将在统计结果中记录。在电子表格中添加两列，一列为动物体长，另一列为归一化速度。

最后，使用单因素方差分析（one-way ANOVA）对归一化速度数据进行分析，并以空载体RNAi作为对照进行事后检验。将四至六条表达RAN肽段GFP的转基因L4期秀丽隐杆线虫（C. elegans）置于直径六厘米的GFP RNAi平板上，在20摄氏度条件下培养。若实验利用RNAi检测特定基因对RAN肽段毒性的遗传效应，则将10条转基因的成年 gravid 线虫转移至两个分别含有空载体RNAi、GFP RNAi或基因特异性RNAi的平板中。

若使用突变体分析RAN多肽毒性中的遗传效应，则将表达相同RAN转基因的10只成年野生型或突变型线虫分别放置于两块空载体RNAi或GFP RNAi平板上。在20摄氏度下培养48小时。从RNAi平板上挑选10组转基因L4期幼虫，每组10只，将每组分别转移至一块3厘米的RNAi平板上。

确保用于检测的线虫均具有表面正常的运动能力。将培养皿放入塑料袋中以保持湿度，并在25摄氏度下孵育。24小时后，通过轻敲体视显微镜下的培养皿并观察其运动情况，分析动物的活动能力。

如果线虫移动距离超过一个体长，则记为可移动，并将其转移至新的三厘米RNAi平板。用铂金丝挑取剩余线虫的头部和尾部进行轻触。若该个体移动距离超过一个体长，则记为可移动，并将其转移至新的三厘米RNAi平板。

如果在第二天时，空载体对照组中未观察到明显的麻痹现象，则终止实验并重新开始。将所有不移动的线虫归为一组，以便于检测其移动是否超过一个体长。计数所有麻痹、产卵袋或死亡的线虫，并丢弃该培养板。

每天继续对动物的瘫痪情况进行评分，持续五到七天。采用生长测定法来检测基因抑制对ALS患者中带有G4C2重复扩增所产生RAN二肽毒性的影响。单独表达PR50 GFP导致完全的生长停滞，但多个基因的敲低可抑制这种发育毒性。

采用视频速度分析方法，检测了特定基因敲低对表达PR50的动物发育运动能力的影响。与空载体RNAi相比，PR50 GFP表达的抑制导致运动能力显著增强，这与预期结果一致。此外，针对蛋白酶体亚基RPN7的RNAi也导致PR50运动能力显著提高。

通过年龄依赖性麻痹实验分析成虫表型时，PR50 GFP 在五天龄时表现出高达 80% 的麻痹率。然而，针对 cul-6 基因的 RNA 干扰显著延缓了麻痹的发生，表明 cul-6 对 PR50 GFP 的毒性作用是必需的。为了确定 RAN 蛋白在秀丽隐杆线虫（C. elegans）神经元中表达时是否引起神经病理学变化，利用神经突触轴突投射检测法（commissure assay）检测了神经元特异性的毒性。

在成年两天的个体中，运动神经元中 PR50 GFP 的表达导致运动神经元出芽现象显著增加。这种神经病理学表型可被胰岛素/IGF-1受体基因同源物 DAF-2 的突变显著抑制，该突变可延缓多种神经退行性蛋白的毒性特征。在行为学检测中，RAN 多肽产生高度外显的表型至关重要。

这些基因或药物可能为RAN多肽疾病提供新的生物标志物或治疗方案。利用这些检测方法，我们进行了全基因组范围的RNAi筛选，以寻找可抑制C9ORF72相关RAN多肽（脯氨酸-精氨酸）的抑制因子。本筛选鉴定出多个全新且保守的基因，这些基因将成为未来机制研究的重点对象。