利用光转化蛋白 Dendra2 在活体中定量分析衰老期间 C. Elegans 的蛋白质周转

该方案可用于在活体且衰老的秀丽隐杆线虫（C. elegans）中追踪并定量目标蛋白的降解过程。这种体内、非侵入性技术仅需简单的显微镜装置，即可可靠地将 Dendra2 转变为明亮且稳定的荧光蛋白。该方法可适用于哺乳动物系统以及斑马鱼。

为了研究蛋白质稳态网络中的周转以及运输和转运过程，需注意在使用蓝光激光扫描时避免意外激活 Dendra2，并针对每个系统和融合蛋白测试及优化成像参数和光转化条件。首先，在 20 摄氏度下培养年龄一致的线虫，使其生长至实验所需的龄期。

成像实验当天，将普通级琼脂糖以3%的浓度溶于双蒸水中并融化。琼脂糖冷却期间，剪去1毫升移液枪头的尖端，以便吸取约400微升融化的琼脂糖。将少量琼脂糖滴加到洁净的玻璃载片上，立即在液滴上方覆盖另一张载片，使两张玻璃片之间形成一层薄薄的琼脂糖垫。

琼脂糖干燥后，小心移除顶部载玻片。准备好足够数量的载玻片后，打开共聚焦显微镜软件并设置激发和发射光路。对于绿色 Dendra2，设置激发波长为 486 至 553 纳米，对于红色 Dendra2，设置激发波长为 580 至 740 纳米。

根据荧光染料的强度调整两个通道的激光功率和增益，并将针孔设为完全打开。选择顺序通道模式，并设置每帧切换一次轨道。将扫描模式设为帧扫描，帧尺寸设为1024×1024，线步进为1。

将平均次数设置为2，采用均值法对单向扫描线模式进行平均。将位深度设置为8位。定义Dendra2转换的多维采集参数。

进行转化和漂白时，使用设定为60%能量功率的405纳米二极管激光器。选择包含两个循环的时间序列，循环间间隔为0.0毫秒，起始和终止方式设为正常。设置漂白在第二次扫描开始后启动，重复30次迭代，并在荧光强度降至50%时停止。然后，将采集时的像素驻留速度设为“快速”以进行转化，设为“中速”以捕获快照图像。

为了将线虫固定在载玻片上，使用永久性记号笔在每张载玻片的琼脂糖垫相对面绘制一个包含四个方格的窗口，并进行编号。在琼脂糖垫中央加入15 µL 左旋咪唑，然后在体视显微镜下用金属丝挑取器将年龄匹配的线虫转移至液滴中。使用睫毛挑取器轻轻地将每条线虫移入方格中的一个窗口内。

当所有线虫被重新定位后，需等待线虫完全停止移动，再将盖玻片盖在液滴上，以在成像过程中固定线虫。随后，将载玻片置于共聚焦显微镜载物台上。进行绿色Dendra2转化时，使用20倍物镜的目镜，在绿色荧光下找到第一条线虫，并聚焦于其头部或尾部。

切换至共聚焦模式，并调节增益和激光功率，以获得饱和但不过曝的图像。在选定的神经元周围绘制一个兴趣区域，并在尾部周围绘制第二个更大的兴趣区域，使其包含第一个兴趣区域。设置第一个区域用于采集、漂白和分析。

设置第二个待采集和分析的感兴趣区域，但不进行漂白。将扫描速度设为最大，开始扫描以转化所选的 Dendra2 神经元。转化后立即使用绿色 561 纳米激光进行活体扫描，以在红色通道中观察 Dendra2，并找到已转化神经元的焦点及相应的最大投影。

迅速将扫描速率设置为较低的像素驻留速度，并以更高分辨率采集两个通道的快照图像。该图像被视为转换后的时间零点图像。然后，使用可识别的名称或编号保存扫描，并加上“时间零点”标签。

为了追踪 Dendra2 随时间的降解情况，打开相应线虫神经元的时间零点图像。使用相同的图像设置，在红色通道中开始实时扫描，并将已光转化的红色神经元调至清晰对焦。随后，在不改变任何采集参数的情况下，以与第一幅图像相同的速度获取一幅快照。

务必仔细设定转化条件，以高效且充分地转化 Dendra2，并在不同时间点保持相同的采集参数。为分析已转化的 Dendra2 图像，需在 Fiji 中打开时间零点和后续时间点的图像，随后打开“分析”菜单并选择“设置测量”。勾选“面积”和“积分密度”选项，并选择使用红色通道获取的图像。

使用多边形选择工具，在时间零点转化的神经元周围绘制一个感兴趣区域。为了准确识别神经元的轮廓，选择“图像”、“调整”、“阈值”以突出显示强度阈值。定义选区后，点击“分析”和“测量”。

将弹出一个结果窗口，其中包含所选感兴趣区域的面积、积分密度和原始积分密度值。对第二个时间点的图像执行相同的选区与测量过程，然后将数值复制到电子表格中。

在此代表性分析中，转换前当样本在红色通道激发时，未观察到红色信号。经照射后，随着HTT-D2的转化，绿色信号逐渐减弱，随后出现红色信号。HTT-D2的表达随时间推移而降解，导致红色HTT-D2信号水平下降，同时随着更多融合蛋白的重新合成，绿色HTT-D2信号可能有所增加。

值得注意的是，尾部区域的神经元活性显著高于头部神经元。此外，在转化后24小时，对照组HTTQ25-D2在头部和尾部神经元中的降解程度均显著高于转化后2小时。然而，在致病型HTTQ97-D2中未观察到这种差异，表明蛋白质稳态网络无法清除在整个神经系统中含较长谷氨酰胺序列的HTT-D2。

在非常年老的线虫中，HTTQ97-D2 的降解效率低于 HTTQ25-D2，表明蛋白质稳态网络在老年动物中无法有效清除亨廷顿蛋白的聚集性且可能具有毒性的形式。重要的是，在年轻的线虫中，尾部神经元能够应对有毒的 HTTQ97-D2，提示可能存在多种协同的蛋白质稳态网络机制共同作用以清除 HTT-D2。对于每个样本，应在转化后立即获取未过曝且未饱和的图像，并在后续时间点对同一样本始终重复使用相同的成像设置。

通过本方案，可以检测蛋白质稳态网络的变化，并借助超分辨率显微镜追踪与疾病相关蛋白的扩散过程。