通过胚胎体冰冻切片分析多能干细胞

第一部分，引言。大家好，我叫Rafael，是巴西里约热内卢联邦大学Stevens Hans教授实验室的一名博士后。

大家好，我叫Ismail。我是一名研究助理，同时也是一名教授。在本视频中，我们将展示如何制备清晰的安卓机体切片。

那么，让我们开始吧。第二部分，材料与设备。进行此操作时，我们需要一种用于冷冻样本的包埋介质。

用于细胞固定的4%多聚甲醛溶液，用于冷冻保护的蔗糖溶液。尖端略微弯曲的针头，用于更好观察EBS的体视显微镜，以及摇床。第三部分。

此处将人胚胎体在非黏附性培养板中进行培养。使用移液器，将所有胚胎体尽可能聚集在一起，以便转移至15毫升锥形管中。小心收集胚胎体（EBS）并转移至该管中。

收集所有囊泡（EBS）非常重要，因为材料量并不多。将EBS转移后，小心弃去培养基。此时应可见管底有沉淀物。接下来可进行固定步骤。

将使用含4%多聚甲醛的PBS（磷酸盐缓冲液）溶液固定EBS。用PFA溶液重悬沉淀物至关重要。随后，EBS在固定液中固定30分钟。

固定后，小心移除PFA溶液。注意避免悬浮EBS，将其替换为含10%蔗糖的PBS溶液，以开始对EBS进行冷冻保护，材料在此溶液中保存30分钟。接下来，我们小心移除10%蔗糖溶液，并将EBS重悬于20%蔗糖溶液中。

再次将 EBS 在此溶液中保存 30 分钟。最后，移除 20% 蔗糖溶液，并替换为 PBS 中的 30% 蔗糖溶液，继续保存 30 分钟。现在我们可以进行 EBS 的定位和包埋。

在我们的实验室中，我们使用空的胶囊壳作为模具。在收集 EBS 时，用蔗糖溶液涂覆移液头内部壁面以阻断 EBS 非常重要。现在我们可以小心地收集 EBS，并等待其沉降到移液头底部。

接下来，将EBS置于模块中央，此位置应为EBS在模块内的最终位置。在体视显微镜下，使用细尖工具尽可能收集并去除多余的蔗糖溶液。

始终注意不要收集ebs。使用尖端略微弯曲的针将所有EBS置于块的中央。最后，用滤纸碎片收集残留的蔗糖溶液。

EBS 在包埋块内的具体位置对于获得高质量切片至关重要。以下是 EBS 在包埋壳内位置不佳的一个示例。在定位 EBS 并去除蔗糖溶液后，从边缘开始向包埋壳内填充 OCT，操作过程中始终注意避免 EBS 悬浮在 Resus 中。

使用移液管去除残留的气泡，并将卵壳振荡 15 分钟。振荡结束后，将 OCT 包埋块置于干冰中冷冻。

此时，您可以将用铝箔包裹的组织块在零下80摄氏度保存，以备后续分析；或者继续进行第四部分——冷冻切片。要制作冷冻切片，您需要一次性或永久性刀片、OCT包埋剂以及经多聚-L-赖氨酸预处理的玻璃载片。将OCT包埋的组织块从冷冻室中取出后，置于冷冻切片机内，待其温度升至零下20摄氏度。

然后将组织块放置在支架上，并与刀片边缘平行对齐。胚胎干细胞（EB）样品比大多数其他组织样品小得多，因此必须确保组织块的整个表面同时接触刀片，以最大程度减少样品损失。定位完成后，将组织块切成10 µm厚的切片，并直接收集到载玻片上。

切片可储存，最好在零下70摄氏度保存，也可在同一天使用。材料可用于免疫组织化学或免疫荧光染色。结论：本文所述方法提供了一种相对经济且易于操作的方案，用于获取由人H九或小鼠US P一干细胞系发育而来的胚胎体的薄冰冻切片。

所得冷冻切片可用于多种实验流程，以分析蛋白质表达或EB形态。