来自噬菌体展示文库的多肽调节间充质细胞中的基因表达并促进单皮质骨缺损中的成骨作用

本实验的总体目标是鉴定能够增强间充质细胞分化并促进骨修复的序列。首先通过生物淘选法分离出能够结合骨组织的噬菌体，随后鉴定这些噬菌体中能够结合间充质细胞的肽序列，并进一步确定基因表达的后续变化。

开展实验以确定肽序列如何递送至骨骼，用于再生目的。最后一步，结合组织学方法观察骨修复情况，这些结果可为体外细胞分化机制和体内骨修复过程提供重要见解。采用生物亲和淘选技术结合噬菌体展示文库的优势在于，我们能够鉴定出靶向骨骼的肽序列，这些肽可用于促进间充质细胞的分化并增强骨修复能力。

最终，这些肽序列可能在骨修复以及骨质减少（如骨量减少症和骨质疏松症）的治疗策略中具有应用价值。基于ULA和Pascal的一项研究，该研究表明体内生物淘选（biop panning）可用于分离靶向血管的肽序列，我们决定采用并改进该方法以探究骨组织中的相关机制。在体内生物淘选过程中，将10周龄C57BL/6小鼠的心脏灌注N-E-B-P-H-D 12噬菌体展示肽库，剂量为每次10次，每次10¹⁰个噬菌斑形成单位。

大约五分钟后，处死小鼠，暴露并解剖股骨，切除两端并取出骨髓。用 PBS 冲洗左侧股骨内外各 10 次。然后将骨组织加入 ER 2 5 3 7 细菌中。

为了去除未结合的噬菌体，使用含有2%脱脂干奶的注射器配合21号针头，冲洗右侧股骨中段髓腔10次。随后用pH为2.2的盐酸甘氨酸缓冲液洗脱结合在髓腔中的噬菌体，并用1 mol/L的Tris溶液中和。

为了扩增噬菌体，将EIT加入ER 2 5 3 7细菌中，培养4.5小时。小心将上清液转移至新的离心管中，并通过添加聚乙二醇对噬菌体进行三次沉淀。加入氯化钠溶液后，于4摄氏度下孵育过夜。

最后，将沉淀重悬于含有0.02%叠氮化钠的TBS中。将噬菌体接种到平板上，以测定扩增后的EITs的噬斑形成单位。对洗脱和未洗脱的噬菌体分别重复体内生物淘选过程四次。

在细菌培养物中扩增混合的噬菌体。使用噬菌体展示试剂盒中提供的98号引物，纯化并定量最终的噬菌体DNA序列。重要的是，计算噬菌体DNA序列的出现频率。

现在合成含有甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-赖氨酸序列的肽段，并扩增D1细胞。D1细胞是一种克隆的小鼠多能性骨髓基质细胞系，由本实验室建立，培养至90%融合度。用胰蛋白酶消化细胞，离心收集细胞沉淀，计数后将细胞接种于明胶包被的腔室载玻片中进行培养，培养24小时后用于肽段染色实验。

用 PBS 清洗细胞，然后用 4% 多聚甲醛固定 30 分钟。接着依次进行封闭孵育：先用甘氨酸封闭，随后使用 BSA Aden 和 BBSA。再使用生物素封闭溶液。

加入100微摩尔的生物素化L七和R一肽。用PBS洗涤细胞三次，每次五分钟。加入1:1000稀释的LOR stripping液，覆盖并用铝箔包裹，在避光抽屉中孵育30分钟。

洗涤细胞，并使用Vector Shield封片剂将盖玻片封片。然后在手术前24小时，于荧光显微镜下分析载玻片。浸泡明胶海绵圆柱体。

将含有20微摩尔肽（L7或R1）或不含肽的PBS缓冲液的凝胶泡沫圆柱体转移至无菌的12孔培养皿中，并在手术前于4摄氏度下冷藏过夜。将凝胶泡沫复合物置于冰上保存，直至使用。

在生理盐水灌注下使用气动磨钻，制备一个大小为3毫米宽、8毫米长的大型椭圆形单皮质骨缺损。通过轻柔敲击将制备好的明胶泡沫植入物插入骨缺损处进行治疗。在预定时间点处死大鼠，小心取出胫骨，检查骨缺损部位，并将获取的胫骨置于10%中性缓冲福尔马林中固定，用于石蜡切片。

最后用苏木精-伊红对所有组织切片进行染色，以标记骨基质。异硫氰酸荧光素标记的腺病毒可实现对体外培养细胞上肽段结合情况的显微检测。此处，肽段与体外培养的间充质细胞结合，以确定肽段对细胞的成骨作用。

体外培养的间充质细胞可用测试肽段处理，以确定细胞形态的变化。例如，在第4天，细胞开始聚集，且随着时间推移，聚集体逐渐增大形成结节。有趣的是，骨组织切片经苏木精和伊红染色后在紫外光下呈现自发荧光。

骨组织与非骨组织之间更高的对比度有助于分析，可定量评估切片中骨组织的存在情况，从而确定经明胶海绵联合多肽处理后缺损部位的骨修复效果。与单独使用明胶海绵相比，在本实验过程中，填充了多肽的缺损部位随时间推移表现出最显著的皮质骨修复。在进行该操作时，务必系统而严谨地记录数据，因为随着实验时间的推移，样本数量必然会大量积累，直至最终筛选出目标多肽组别。

体内生物淘选技术的发展使得我们能够鉴定出靶向骨组织的肽类物质，这意味着我们现在拥有了可用于骨修复和骨质流失治疗的潜在药物。骨修复的一个潜在机制也参与了骨质流失过程。更深入地理解这些机制，并拥有可用于治疗骨折延迟愈合和骨质疏松等疾病的有效工具，将有助于改进现有医疗方案，提升临床治疗水平。