条件性Stat3基因敲除小鼠模型的骨骼表型分析

基因工程小鼠模型是体内研究人类疾病机制的有力工具。分析小鼠的骨骼表型是骨骼研究的基础。本文介绍了一些典型的骨骼表型分析技术，可能对刚进入骨骼组织研究领域的研究人员具有参考价值。

进行本实验操作时，请注意动物实验耗时较长，因此每次实验应尽可能收集更多高质量的样本，即使短期内不需要这些样本。首先将已处死的小鼠仰卧放置，用手轻轻手动脱位双侧髋关节。使用眼科剪从胫骨远端垂直剪开皮肤，然后将后肢的全部皮肤剥离干净。

用剪刀剪断右侧髋关节和膝关节的关节韧带以分离后肢。然后在骨骼两端进行切割，使骨骼能够完全浸入4%PFA中。切除转子以及腓骨连接处。

将后肢浸入4%PFA中，保留右后肢用于石蜡切片。用剪刀剪开左侧髋关节和膝关节的关节韧带，并轻轻去除软组织。分离胫骨和股骨，分别浸入75%乙醇中。

将股骨保留用于微型CT扫描，胫骨用于钙黄素和茜素红双荧光标记。制备石蜡切片时，用PBS轻轻冲洗固定后的右侧后肢，每次10分钟，共冲洗三次。然后将组织置于15% EDTA中，使用超声波脱钙仪脱钙三至四周，直至骨骼可以弯曲，每隔一天更换一次脱钙液。

脱钙后，用 PBS 清洗样本三次，并将其浸入 75% 乙醇中，于 4 摄氏度下过夜。第二天，依次将样本浸入 95% 乙醇、100% 乙醇和二甲苯中，每种试剂各一小时。将样本在等体积的二甲苯与石蜡混合液中浸渍 30 分钟，然后于 65 摄氏度下浸入石蜡中过夜。

为了包埋样本，将样本浸入石蜡中，并使股骨和胫骨呈90度角放置。当石蜡完全冷却后，从包埋盒中取出样本。编号后于-20摄氏度保存过夜。

将石蜡切片在 65 摄氏度下烘烤 30 分钟，然后将其浸入二甲苯中 10 分钟以脱蜡。每次使用新鲜的二甲苯，重复浸泡三次。依次将切片浸入 100% 乙醇、95% 乙醇、70% 乙醇和蒸馏水中，每步各 5 分钟，以完成再水化。

使用TRAP染色试剂盒配制染色液，并将其预热至37摄氏度。向每个切片加入50至100微升染色液，置于37摄氏度的湿盒中孵育20至30分钟。每隔5分钟在光学显微镜下观察破骨细胞的染色情况，直至可见红色的多核破骨细胞为止。

然后用水终止反应。将切片置于苏木精溶液中复染30秒，并将其浸入1%氨水溶液中1分钟以形成稳定的蓝色。随后用缓慢流动的自来水冲洗。

使用中性树胶和盖玻片封片，并在室温下过夜干燥。使用显微镜采集3至5个视野的图像，并用ImageJ分析小梁骨周长。使用直线工具测量标尺的长度，记为L1；然后使用分段线工具测量小梁骨周长的长度，记为L2。计算实际长度，并计数含有三个以上细胞核的TRAP阳性细胞数量。固定后，用PBS轻轻洗涤胫骨标本3次，随后将标本依次浸入95%乙醇、100%乙醇和二甲苯中，每次5分钟。

将样品浸入丙酮中12小时，再浸入一半丙酮和一半树脂的混合液中2小时，然后在纯树脂中于干燥烘箱中过夜。将纯树脂加入合适的硅胶包埋罐中，并将样品放入罐内，避免产生气泡。在60摄氏度的干燥烘箱中对树脂聚合48小时。

使用旋转式切片机将样品连续切成5 µm厚的切片，并将剩余样品与干燥剂一同置于室温下保存。用镊子将切片转移至一滴75%乙醇中贴片，并使用中性树胶加盖玻片封片。采用荧光显微镜采集红色和绿色荧光标记图像。

通过构建破骨细胞特异性 Stat3 基因敲除小鼠，研究 Stat3 缺失对破骨细胞分化的影响。经显微CT进行股骨重建及定量分析表明，与野生型小鼠相比，Stat3 Ctsk 小鼠的骨量增加。采用苏木精-伊红（H&E）染色对野生型和 Stat3 Ctsk 小鼠股骨的组织形态学进行观察。

使用TRAP染色检测破骨细胞生成活性。破骨细胞是体积较大的多核TRAP阳性细胞。与野生型小鼠相比，Stat3 Ctsk小鼠中TRAP阳性破骨细胞的数量较低，表明Stat3缺乏会损害破骨细胞的形成。

采用钙黄绿素与茜素红双标记法检测成骨情况。钙黄绿素与茜素红荧光之间的区域代表新形成的骨组织。破骨细胞中 Stat3 的缺失并未影响骨合成代谢。

选用软骨两侧对称且清晰显示M形线的矢状面石蜡切片进行本研究。在后续研究中，我们将纳入更多骨骼系统的特征，例如力学特性。