计算机辅助的大规模胰岛质量、大小分布及结构的可视化与定量分析

本实验的总体目标是在有限的样本内收集无偏且具有代表性的数据，并精确分析组织复杂的三维结构。该目标首先通过获取免疫组织化学染色的胰腺切片的虚拟切片来实现，随后使用 ImageJ 软件中的 IHC 虚拟切片宏对这些虚拟切片进行定量分析，最后利用为 Mathematica 编写的脚本对数据进行分析。

接下来，使用 Image J 对虚拟切片进行三维重建。该流程的最后一步是利用 Slide Book 软件获取一系列独立的胰岛图像，并通过 Stereo Investigator 软件手动将图像堆栈进行三维映射。最终，通过结合三维成像与手动映射的方法，可以获得每个胰岛细胞的精确胰岛结构及其三维坐标。该方法有助于回答肥胖与糖尿病研究领域中的关键问题，例如生理及病理生理条件下如何影响胰腺β细胞质量、胰岛分布及胰岛结构。

该技术的应用前景涉及肥胖症和糖尿病的诊断或治疗，因为对β细胞质量变化的深入理解将有助于推动治疗干预措施的开发与评估。尽管本研究中描述的方法主要针对胰腺的动态免疫组织化学分析提供了见解，但该方法也可应用于其他多种生物体和组织。该方法的可视化演示至关重要，因为计算机辅助分析步骤较难掌握。

由于在二维和三维空间中分析如此大规模数据集具有复杂性。首先将载有完整免疫组织化学染色胰腺切片的洁净载玻片放入荧光显微镜的载物台中。打开Stereo Investigator软件，通过点击“acquisition”来观察样本。

然后进行活体成像。使用视频直方图窗口确定每个通道的曝光水平，该窗口显示荧光强度。在此示例中，通道二用于 DAP P，通道三用于 GFP，通道四用于 RFP，通道五用于 sci five，通道六用于 SCI seven。

使用相机设置窗口，调整曝光水平，使荧光强度逐渐减弱。在视频直方图的右端，可通过显微镜的调焦旋钮对图像进行聚焦。在创建虚拟切片之前，通过在远离样品的区域点击屏幕来勾勒样品轮廓，该点击位置将作为参考点。

当轮廓绘制完成后，点击样品轮廓的周围区域。单击鼠标右键并选择“关闭轮廓”，以连接轮廓的起始点和终点。轮廓关闭后，选择“采集”以获取样品的虚拟切片，然后点击“获取虚拟切片”。当虚拟切片窗口选项打开时，选择“高速采集”，并禁用手动模式。

取消勾选“手动”旁边的复选框以进行自动对焦。保存文件。通过右键单击并选择“添加到对焦位点列表”来校准预焦点。

在虚拟切片预览中手动对焦多个随机区域。对多个位点完成对焦后，通过右键单击并选择“开始虚拟切片”来启动虚拟切片。完成第一个样本的虚拟切片后，切换至下一个通道，并相应调整曝光时间。对每个通道重复此操作，以实现对小孔结构的定量分析。使用名为 I-H-C-V-S 的 ImageJ 宏处理图像，该宏首先为分析准备已加载的图像，然后对小孔的特征（如细胞组成）进行量化。

I-H-C-V-S 宏将堆栈拆分为相应的颜色通道。在 Image J 中，将每幅图像转换为8位黑白掩膜。经过自动强度阈值处理后，再通过算术方法将各个通道图像合并为一幅复合掩膜。

对复合图像使用 Image J 内置的颗粒分析，将识别出感兴趣区域（ROIs），同时排除小于一个β细胞的颗粒。对感兴趣区域的定量分析使用 Image J 进行，可生成包含细胞参数的电子表格。

将汇总结果保存到 Excel 电子表格中。存储每个小孔的面积、周长、圆形度、小孔直径以及小孔中心位置等数据，并附上图像中标注的相应编号。可按照书面实验方案中所述方法对这些参数进行计算分析，以获取小孔分布和频率分析等信息。通过运行脚本将目录中所有 JP2 格式的图像转换为 TIF 文件，从而进行虚拟切片的三维重建，TIF 格式将用于由虚拟切片构建和量化三维图像堆栈。

此处使用一个名为 I MJ two two tiff 的脚本。将该脚本复制到包含 JP two 图像的目录中。在 Linux 命令行中，通过在控制台输入 dot slash I am JP two two TIFF，然后按回车键来运行该脚本。

当所有捕获的图像均已从 JP2 格式转换为 TIFF 文件后，即可用于 ImageJ 中的分析。使用 ImageJ 打开第一个样本的所有图像（本例中来自人胎儿胰腺），然后通过选择“图像”、“颜色”，再选择“合并通道”将其合并为一个图像。对每个样本重复此过程，直至所有样本均被合并为单个图像。使用多边形选区工具选中不需要的区域，以对图像进行清理。

通过选择“编辑”，然后“填充”来完成填充。将每幅图像转换为RGB彩色图像。最后，将图像创建成图像栈，之后可使用StackReg插件进一步对齐。

最终，合并通道并组合图像可生成整个胰腺中所有胰岛的三维拼接图像。为采集图像序列，需将完整胰腺样本置于显微镜下。若使用水浸物镜，则需滴加水。

打开切片浏览软件，在焦距控制窗口中按下 Ctrl + Shift + E 以进入采集和焦距控制界面。根据孔眼的大小，将物镜设置为 20 倍或 40 倍。若需使用显微镜目镜定位孔眼，请将 bin 设为 2 倍，并将滤光片组设为用户 1。

在焦距控制窗口中，发射光选择应设置为100%眼睛，中性密度应设置为一档GFP眼，然后打开透射光以在幻灯片浏览器中观察样本。返回焦距控制窗口，将滤光片组切换至固定位置，然后点击G-F-P-D-S。使用操纵杆尽可能将视野中心对准相机一窗口中的孔径。

将焦距调整至小孔中心附近，以便清晰观察到细胞。在焦距控制窗口中，选择 zab。使用显微镜控制功能滚动至能够清晰辨认结构特征的小孔最上层位置，然后单击“设置顶部”。

滚动至小孔底部并点击“set”。底部点击“go”。要返回到采集窗口中的参考点，请点击“advanced”，然后点击“alternate to channel mode”。

将窗口右侧的 bin 因子设置为 2 倍，捕获类型设置为 3D，勾选使用顶部和底部位置，并在捕获后返回中心体积。将步进大小设置为 3。在滤光片组框下方将滤光片组设置为 live。

选择 DAP、E-D-S-U-G-F-P-D-S-U-R-F-P-D-S-U 和 SCI 的五个 DSU。对每一个，点击“调整曝光”下的“查找最佳”，然后点击“测试”以确保所选曝光合适。

单击“开始”以启动采集。采集完成后，根据需要调整水平，并将RFP的显示颜色更改为白色。保存幻灯片，然后转到“查看”→“导出TIFF序列”。

在幻灯片名称末尾输入一个短横线并保存。系统将生成数十个独立的TIF文件，因此建议将每个孔的图像堆栈保存在单独的文件夹中。要映射图像堆栈，请打开Stereo Investigator软件。

通过在图像缩放菜单中打开图像堆栈来查看图像。将图像间距设置为三微米，以校正两倍弯曲。在幻灯片簿中选择覆盖 X 和 Y 方向的缩放，并使用指定的源进行 X 和 Y 方向的缩放。

在X和Y中心均输入0.65，然后点击缩放按钮，并在宏观窗口中感兴趣的胰岛中心区域至少标记一个细胞。使用适当的标记物，β细胞将显示为绿色，α细胞将显示为红色，δ细胞将显示为白色。

用标记物标记细胞核中心的细胞，如果样本已用DPI染色，细胞核将呈蓝色；使用标记物二标记β细胞，标记物五标记α细胞，标记物六标记δ细胞。至少标记一个细胞后，通过顶部菜单中的图标显示正交视图，勾选Z滤镜并选择对称。

范围应设置为15.00。从Z=0.0开始，使用鼠标滚轮逐层浏览各层面，并使用适当的标记工具在每个细胞深度的中心位置标记一次，每个细胞仅标记一次。完成所有Z层面的标记后，可取消勾选Z滤波器复选框。

这将显示所有Z层的全部标记。当所有细胞均被标记后，将文件保存为DAT文件，然后转到文件导出轨迹。

将描迹保存为 TXT 文件。最后，单击新建数据文件以清除工作区，然后开始绘制新的扣眼。通过对免疫组织化学染色的胰腺样本生成虚拟切片，可将整个胰腺中的α、β和δ内分泌细胞作为胰岛整体进行观察：胰岛素的免疫组织化学染色呈绿色，胰高血糖素呈红色，生长抑素呈白色，DAP 呈蓝色。

图像在自动设定阈值后被转换为8位掩膜。此处显示的是合并的复合图像。然而，使用虚拟切片进行孔眼分布分析还可实现各通道的独立分析。

此处展示了各通道的视图，以显示δ细胞、β细胞和α细胞。对复合掩膜进行颗粒分析，每个小孔结构均被编号并以蓝色高亮显示。复合掩膜的颗粒分析结果以数据表形式输出，包含所检测到的每个小孔的参数，例如胰岛面积、周长、圆度以及各种直径，这些小孔的ID与复合掩膜上编号标签相对应。

对这些图像进行大规模分析，可生成总眼孔数量及大小分布的直方图，并对α、β和δ细胞区域进行详细比较。通过眼孔定位及对细胞组成和结构的数学分析，可以从上传至Stereo Investigator中的人眼孔三维重建图像堆栈中揭示出单个焦平面。在此图像中，β细胞呈绿色，α细胞呈红色，δ细胞呈白色，细胞核呈蓝色。

在捕获不同的眼状结构后，此处于不同海平面标记了α、β和δ细胞，展示了三个相隔10微米焦平面的荧光图像及相应的图谱数据。当α、β和δ细胞在多个平面上完成标记后，即可实现眼状结构的三维可视化。此处展示的是基于眼状结构图谱所获坐标生成的四分之一切片眼状结构的三维重建图像。

此外，对映射的细胞簇进行自动化的数学分析可以展示细胞组成和组织结构。此处展示了单个细胞群体内两个细胞之间距离的相对频率，以及两个不同细胞群体之间细胞距离的相对频率。

还展示了α细胞与α细胞、β细胞与β细胞以及δ细胞与δ细胞之间距离分布的累积概率。可对这些概率进行双样本柯尔莫哥洛夫-斯米尔诺夫（Kolmogorov-Smirnov，KS）检验，以获得相应的KS距离。一旦掌握该技术，即可在四小时内完成对整个组织切片的大规模成像与分析。

一块组织的三维重建可在30分钟内完成。最后，如果操作得当，三维成像和手动绘图可在四小时内完成。在尝试此操作时，重要的是从高质量的切片免疫组织化学染色开始。

后续分析的准确性完全取决于原始数据。此外，请确保您的计算机至少具有八千兆字节的内存，以便在开发后处理如此大规模的分析。该技术不仅为肥胖症和糖尿病领域的研究人员，而且为广泛使用标准病理分析的许多其他领域的研究人员开辟了道路。

当样本数量有限时，这种方法可能尤为有用。观看本视频后，您应能充分理解如何在有限的样本量下，利用标准技术采集无偏且具有代表性的数据。正如我们在胰腺胰岛分布研究中所展示的那样，仅选择特定区域可能无法代表整体情况。