使用具有透气材料技术的 HYPERStack 器具进行封闭式细胞培养的方案

本实验的总体目标是演示 Corning Hypers stack 培养容器在封闭系统中的正确使用方法。首先通过重力加液法将培养基接种并注入容器中，随后在每一层中分离细胞悬液，并对细胞进行培养孵育。

孵育结束后，移除用过的培养基。该实验方案的最后一步是从超堆叠培养容器中收获细胞。最终获得气体扩散结果，以显示在使用超堆叠封闭系统培养至汇合时，细胞获取氧气的能力。

高通量堆叠培养皿采用透气材料的主要优势在于其可为细胞生长提供更大的表面积。通过消除容器中的顶空，我的同事 p pardo 将演示如何使用高通量堆叠培养皿的封闭系统操作流程。高通量堆叠培养皿由多个层（stat）组成，每一层即为一个独立的细胞培养单元，由顶板和透气膜构成。

细胞在此隔室内进行培养。液体管路将模块内的各层微流控层连接在一起。通过管路将模块连接，形成由12层的倍数构成的反应容器。

该管路系统可让用户对整个容器进行一次性的流体操作。空气管路系统还将各层 stat 层连接在一起，但在添加液体时用于排出容器中的空气，并设有填充线，用于各层之间的填充操作。stat 层是一个开放的空气空间，称作气管空间，可通过每层的透气膜实现气体交换。

液体处理管路连接至液体歧管，是一种可定制的组件，用于完成所有封闭系统的液体操作，可在保持无菌条件的同时释放多余空气。使用通气管路。通气管路连接至空气歧管，并配有空气过滤器。

与液体处理管路相连的是冲洗管路和滤器，用于在填充容器后将液体处理管路中的液体排出。本实验方案中还使用了康宁堆栈操作器（Corning Stack manipulator，简称CSM），这是一种辅助装置，用于在使用过程中将容器准确放置到指定位置。本演示中，以一种具有36层透气膜的封闭式细胞培养容器为例进行展示。

然而，使用CSM时，有关在12层培养瓶上使用加样楔进行此操作的详细步骤可参见随附的书面方案。首先，在接种培养基管之前，准备3.9升袋装培养基。将血清袋与培养基袋连接并充分混合，以获得所需的血清浓度。

使用大号袋夹在袋子中夹住约 300 毫升的培养基。这将确保在灌装过程中使用所有接种的细胞，且培养基袋中无残留细胞。将培养基置于袋架上以接种培养基。

用细胞悬液填充连接在管路中的注射器。通过管路焊接，将装有细胞悬液的注射器连接到培养基袋上。从注射器到袋子使用三段16英寸以上的管路。

将细胞悬液注入培养基袋中并充分混匀。接种后的培养基袋可通过管路焊接或使用多功能连接器，连接至容器的3/8英寸液体处理管路。今天我们将使用管路焊接方法。

关闭容器的液体处理管和冲洗管上的夹子。将36层容器放入CSM的装载位置。将通气滤器管钩入CSM上的固定夹中。

拧紧盖子，并将 CSM 移至填充位置，使空气过滤器处于最高位置，以防止填充过程中被润湿。10 度的倾斜角度还可在填充过程中使液体在各层之间平衡，并通过填充管路排出空气。将培养基袋与反应器置于同一水平位置，同时保持追加管路夹闭。

打开液体处理管夹和培养基袋夹，使液体流入容器。使用培养基袋支架将培养基袋抬高，以帮助细胞悬液流入容器。持续填充容器，直至所有接种的培养基完全进入容器。

培养基袋的上部应仍含有 300 毫升培养基。当液体接近上部通气管路时，打开培养基袋上的夹子，继续向容器中灌注。通过降低培养基袋的高度来减缓灌注速度，以防止过度填充。

缓慢将液面升至填充线，并夹紧液体处理管路。将CSM中的容器移至隔离位置，使两组歧管均处于最高位置。将培养基袋降至容器高度以下。

将追加滤器保持在直立位置，打开追加管夹。这会将液体处理管中的培养基排回至培养基袋中。待管路排空后，关闭培养基袋管路上的管夹。

保持chase管过滤器处于直立位置。打开容器液体管路上的夹子，使残留液体流入容器并达到平衡。等待一到两分钟，以完成此过程。

接下来，将容器在 CSM 中旋转，使歧管位于左侧。将容器降至 CSM 的装载位置。关闭追加管路和液体处理管路两端的夹具。

现在可将培养基袋从容器中移除，也可保持连接以备后续收获步骤使用。若需存放已连接的培养基袋，请将其卷起并置于容器储物托盘的固定带下方。最后，将容器转移至培养箱。在搬运容器时，应注意防止任何液体进入通气滤膜。

通过将歧管端略微向上倾斜即可实现此操作。开始收获程序时，将细胞收集管、关联溶液和淬灭袋焊接在一起，形成收获袋组件，并确保所有管路夹具均处于关闭状态。从培养箱中取出容器，将其放入CSM的装载位置。

松开固定带下方的培养基袋，并将其悬挂在袋上。随后直立放置，拧紧盖子以固定容器。将通气管路钩入固定夹中，并将CSM移至填充位置。

确保培养基袋悬挂在支架上时低于反应容器。打开培养基袋管路及容器液体处理管路的夹子，使培养基流入连接的收集袋中。当容器内液体排空至约四分之三时，将CSM设置更改为最终排空位置。

当容器和液体管路为空时，抬起管路，使培养基流过废液袋管路上的夹子。随后关闭液体管路上的夹子和废液袋管路上的夹子。通过管路焊接将废液袋更换为收获袋组件。

使用细胞解离袋支架将细胞解离袋组件抬升至高于容器的位置。将CSM置于填充位置。打开细胞解离溶液管夹和收获袋组件夹，将溶液转移至容器中。

转移完成后，关闭液体处理管路和细胞解离溶液管路的夹子。接着，在保持水平定位杆打开的状态下，将 CSM 移至装载位置。使用轮子轻轻左右摇动容器，使溶液均匀分布在细胞层上。

在摇动过程中，容器偶尔可返回填充位置，以保持溶液的均匀分布。溶液充分分布后，松开CSM上的杠杆，将容器锁定在填充位置。在细胞所需的解离时间内，保持容器处于此位置。

以浊度作为判断细胞脱落的依据。细胞脱落后，将 CSM 移至加载位置。打开淬灭袋夹具和液体处理管路夹具，使淬灭介质进入容器。

关闭液体处理管路上的夹具。转移完成后，将CSM返回至装载位置，并握住水平定位手柄，使容器左右摆动。利用袋架，将收获袋组件的位置降至容器液面以下。

将 CSM 调整至空位。打开容器液体处理管夹，将细胞溶液转移回淬灭袋中。将 CSM 返回至装载位置，并使用管路密封器断开收获袋组件与容器的连接。

现在，细胞悬液已准备好用于传统的细胞培养系统。在Headspace条件下，培养基中的氧气在三天内平均消耗约50%。在培养过程中，该数据展示了在同一培养系统中，细胞水平处氧气浓度随时间下降的情况（单位为毫克/升）；在培养基高度为三毫米的情况下，培养基与Headspace交界处的氧浓度梯度比细胞层处高出近50%。

图中显示了细胞生长期间高氧堆栈气管空间中的氧气百分比。结果显示，在96小时内，各层之间为每层透气膜底部提供氧气的氧气浓度保持恒定。这证明了细胞在生长至汇合过程中能够持续获取氧气。

观看本视频后，您应充分了解如何在封闭系统中填充和收获康宁超堆叠培养容器。