通过连续补料实现球状体大规模扩增哺乳动物细胞的营养调控

该过程的总体目标是在受控的营养条件下培养大量细胞，使用细胞培养实验室中常见的常规设备。相关算法可在实验设定范围内实现对营养物质的控制与调节。

该方法可为大规模细胞培养应用中的关键问题提供解答，例如人类细胞治疗。该技术的主要优势在于能够实现细胞的大规模培养，同时确保营养物质和气体的均匀分布。

这可以实现比静态或批量补料细胞培养更高的细胞密度，提高产量，并减少细胞损失。该操作可使用大多数细胞培养实验室中常见的设备完成。由于该技术需在无菌条件下按特定顺序执行大量步骤，初学者可能难以掌握，因此对该方法的可视化演示可能对新研究人员有所帮助。

收集喂养系统所需的五个主要组件：一个中等容量储液罐、一台蠕动泵、一个搅拌式生物反应器、一个废液储液罐以及一套定制设计的管路取样装置。使用一个一升的玻璃瓶建立培养基储液罐。

使用一个两升的玻璃瓶作为废液储液罐。使用一个250 mL容积的玻璃反应器作为搅拌式生物反应器。采用数字蠕动泵，或具有八通道泵头的类似泵，以控制培养基的更换。

使用坚硬且可高压灭菌的塑料组装储液器和经过改造的生物反应器盖。盖上设有不锈钢管道穿孔端口，可通过无菌过滤器提供通风，并实现储液器与生物反应器之间的培养基转移。将由多孔玻璃曝气管制成的出流管连接至改造后的搅拌悬浮生物反应器盖上。

使用聚偏氟乙烯管路连接件和耐用的蠕动泵管路组装可高压灭菌的灌流管路系统。管路段的长度应根据各组件之间的距离确定。采用两种不同管径组装进料管路。

使用L/S 14规格的管路作为从生物反应器延伸至培养基储液罐的主输液管。在管路中间用于泵段的部分插入一段较短的L/S 13规格管路，并使用合适的PVDF接头。在较短的泵段管路两侧，使用标准的PVDF带齿管接头将两段L/S 14规格管路连接起来。

使用较大直径的L/S 16管路组装用于废液排出的管段，并在中间插入一段较短的L/S 14管路用于泵送部分。该组装方法与使用PVDF带软管接头适配器构建进样管路的方法相同。通过将三段较短的L/S 14管路连接在一起，组装成管路组件的最终部分。

使用T型高压过滤器（HVDF）接头将两段管路连接在一起，并在其中两段管路上使用两个小型软管夹固定。将样品组件连接到生物反应器盖子上附带的不锈钢样品接头上。灭菌后，将在其中一个夹紧的管路段上连接一个无菌气体过滤器，用于气体排放。

另一个用于连接无菌取样注射器。在开始实验前，按照文本方案所述，将取样装置与生物反应器连接后一同进行高压灭菌。使用该装置可根据需要从生物反应器中采集无菌样品，且不干扰连续补料过程。

将无菌通气口连接至旋转烧瓶盖、培养基容器、废液容器和取样口的相应位置。按照文本方案所述培养并收获细胞。在生物安全柜中，让细胞在胰蛋白酶中室温孵育两到三分钟，然后收集至锥形管中。

随后收集少量细胞样品，并用台盼蓝染色。使用显微镜和标准血细胞计数板，按照文本方案中所述的台盼蓝染色法计数细胞密度。根据每种实验条件，将所需数量的总细胞加入无菌搅拌式悬浮生物反应器中。

使用移液管向搅拌悬浮生物反应器中加入培养基，以达到所需的总体积。将含有细胞的搅拌悬浮生物反应器转移至细胞培养孵育箱内的搅拌平台上。在37°C、5% CO₂、100%相对湿度及70 rpm搅拌速度的条件下，在生物反应器中培养细胞三天，期间不进行换液，以促进类球体的形成。

类球体形成后，将搅拌悬浮生物反应器从培养箱中取出。在生物安全柜中组装连续 feeding 系统的组件。首先，用所需的培养基填充新鲜培养基储液器，然后连接到进料管的一端。

同时确保新鲜培养基储液罐通过无菌滤器正确通气。应在生物反应器进液口更换无菌滤器，以在培养基进入生物反应器前对其进行过滤。将废液管路连接至培养基废液储液罐，并确保废液储液罐通过无菌滤器正确通气。

将搅拌悬浮生物反应器放置于培养箱内的搅拌台上，培养条件与球体形成阶段相同。将新鲜培养基储液瓶放入附近的迷你冰箱中。确保进样管路能够从冰箱中引出，且不影响冰箱门的关闭。

还需注意，冰箱或培养箱的门不得夹紧进液管路。废液培养基储液瓶可放置在培养箱外实验台面上方便的位置。将剩余的管路末端引入培养箱内，并将进液管连接到生物反应器入口端口的滤器上。

然后将废液管连接至流出管接口。接下来，将进料管和废液管的泵管段放入泵头中，确保方向正确，使得进料管能将新鲜培养基从培养基储液罐泵入搅拌式悬浮生物反应器，而废液管则能将培养基从生物反应器泵出至废液储液罐。根据文本方案中所述的调整后进料速率公式计算进料速率。

利用包含细胞计数信息的最新样品，结合生长速率预测结果和培养基中葡萄糖的测定值，估算为维持培养体系中目标葡萄糖浓度所需的补料速率。根据计算得到的补料速率设定泵速。在每个取样点重复计算补料速率，并相应调整泵速。

采用静态搅拌悬浮生物反应器和连续灌注搅拌悬浮生物反应器培养方法，对Beta-TC6胰岛素瘤类球体培养物进行中等葡萄糖浓度测定。使用标准高葡萄糖培养基进行喂养。连续灌注可消除葡萄糖浓度波动，但在培养期间，培养基中的平均葡萄糖水平仍发生显著变化，且远高于生理范围。

调整喂养能够消除波动，并在培养期间维持葡萄糖浓度接近生理水平。此处比较了在21天培养期间，采用常规培养基更换的搅拌悬浮生物反应器、恒定喂养速率的搅拌悬浮生物反应器培养以及调整喂养速率的搅拌悬浮生物反应器培养的细胞生长情况，以细胞数量的倍数变化表示。通过遵循该程序，可实施其他方法以回答更多问题，例如新细胞系的营养需求或特定实验结果。

该技术问世后，为细胞生物学领域的研究人员探索人类癌症或其他疾病患者细胞的代谢需求铺平了道路。观看本视频后，您应能够充分理解如何组装灌注细胞培养系统，以更好地控制培养条件并最大化细胞产量。请务必注意，操作人类细胞可能具有极高危险性，在进行该操作时，必须采取相应预防措施，例如防止血液传播病原体的感染。