一种用于微尺度细胞刺激实验的多功能自动化平台

本实验的总体目标是组装并使用一种基于半自动微流控技术的平台，用于培养和刺激少量细胞群体，并回收细胞裂解液以进行分子分析。首先，在经纤连蛋白包被的微毛细管（称为细胞灌注室）中建立微尺度细胞培养体系；第二步是将灌注室连接至数字微流控（DMF）模块，该模块可灵活地将试剂输送至微尺度细胞培养体系中或从中移除。

接下来，数字微流控模块将目标刺激物递送至灌流室，细胞在预设的暴露时间内与该刺激物共同孵育。最后，通过化学方法裂解细胞，并将裂解液回收至数字微流控模块中用于分子分析。回收的裂解液随后采用定量反转录聚合酶链式反应（qRT-PCR）进行分析，以表征细胞群体对刺激物的转录响应。

与传统的细胞培养方法相比，该技术的主要优势在于，能够利用少量细胞进行细胞刺激研究，同时使用少量试剂。我们的研究已证明，该平台在微尺度上对细胞和试剂的精确操控，可最大限度地减少实验间的差异。该平台还具有很高的多功能性。

数字微流控模块能够以高度灵活的方式将细胞和试剂引导至灌注室或从灌注室引出，从而可快速、简便地定制和重新配置实验。首先，配制无菌的纤连蛋白溶液（50 微克/毫升），并使用多通道注射泵将 30 微升该溶液吸入每个微毛细管中，以加速微毛细管内表面的包被。在 37 摄氏度下孵育 2 小时后，吸出并弃去纤连蛋白溶液，然后让微毛细管在室温下干燥 6 小时。

接下来，使用卡式接头将涂有光纤镍的微型毛细管或灌流室连接到聚碳酸酯管路，并将管路连接至注射泵。此处所示装置采用支持六个灌流室的辅助端口注射泵。使用胶带将每个灌流室的主体固定在加热块上，并将加热块的温度设定为37摄氏度。

然后将灌流室的开放端浸入含有细胞的储液器中，细胞用新鲜培养基悬浮，浓度为每毫升100万个细胞，均匀分散。指示注射泵将10微升细胞悬液吸入每个灌流室中。随后将灌流室的开放端从细胞悬液中取出，并指示注射泵吸入足够的空气，以推动液柱进入固定在加热块上的区域。

将细胞在37摄氏度条件下孵育1至2小时，使其贴附于包被有纤维连接蛋白的灌注腔内表面。在此期间，将灌注腔的开口端转移至含有新鲜培养基的新储液槽中。贴壁完成后，指示注射泵将液体段推入废液，并向每个灌注腔吸入10 µL新鲜培养基，随后吸入足量空气，使新鲜培养基位于贴壁细胞上方。

继续在 37 摄氏度下孵育细胞，每两小时更换一次培养基，直至细胞培养物充分平衡并扩增。图案。带有 46 个氧化铟锡电极的数字微流控（DMF）模块的底板。采用标准光刻技术，通过化学气相沉积在 DMF 模块的底板上涂覆 5 微米厚的 Lene C，然后以旋涂法覆盖 50 纳米厚的 Teflon af。

接下来，将未图案化的氧化铟锡玻璃基底旋涂上50纳米厚的聚四氟乙烯AF，用作上层电极板。使用金属压缩框架将电极板固定在带有凹槽的聚合物模具中，以保持电极板之间400微米的间距。该间距与2.5平方毫米的驱动电极面积相结合，使每个电极对应的液滴体积为2.5微升。

然后将带有聚四氟乙烯涂层的转移微毛细管插入数字微流控芯片两板之间的空隙中，每根毛细管应定位至其对应的驱动电极边缘，并延伸至转移路径的另一端。在微毛细管上安装帽式接头。

接下来，连接电气接头以向氧化铟锡电极施加电压。电极激活程序通过运行预设脚本的计算机控制电子接口自动完成。然后，向数字微流控（DMF）模块上的储液池中加入用于细胞刺激、洗涤和裂解的适当试剂。

在某些情况下，最好在即将使用时才从已加载的板载储液器中取出刺激物，并将其加载到数字微流控（DMF）模块上，分配微滴。测试微滴的操作，包括微滴在DMF模块与转移微毛细管之间的运输。Blais。首先，用新鲜培养基配制刺激物，其中添加终浓度为100微克/毫升的0.1% Pluronic F127。

然后将80至100微升的刺激液加入指定的片上储液池中。接着，将灌流室的开口端从介质储液池中取出，插入固定在转移微毛细管末端的帽式接头中，随后指示注射泵将灌流室内的液塞转移至废液容器。接下来，指示数字微流控（DMF）模块生成10微升的刺激液滴，并通过转移微毛细管将其输送至灌流室中。

如有需要，将细胞在37摄氏度条件下与刺激物共同孵育1至4小时。在刺激结束后，定期更换为新鲜的刺激物。指示注射泵将刺激物输送至废液容器，并指示DMF模块向每个灌注室输送10微升洗涤缓冲液。

将细胞与洗涤缓冲液孵育五分钟。然后将洗涤缓冲液更换为10 µL裂解液，继续孵育五分钟。接着，指示注射泵将每份细胞裂解物转移至数字微流控（DMF）模块。

取下数字微流控（DMF）模块的上层板时，注意不要将板子侧向倾斜，以免导致液滴之间的交叉污染。最后，使用移液器手动从开放的DMF模块中收集裂解液，用于平台外分析，例如通过定量逆转录聚合酶链式反应（qRT-PCR）进行基因表达谱分析，以准备进行下一次实验。首先，将转移用微毛细管、CAPITE接头和DMF模块板浸入10%次氯酸钠溶液中，在室温下处理10分钟，随后用异丙醇冲洗DMF模块板，再用去离子水冲洗，并用氮气吹干，最后在160°C下烘烤10分钟。

本方案中描述的接种方法导致每个灌注腔室中约有500个miren巨噬细胞黏附。在37摄氏度下用生长培养基孵育细胞16小时后，细胞数量增加一倍，达到每个灌注腔室约1000个细胞。此处展示的是对四个已知在先天免疫应答细菌过程中发挥重要作用的基因进行定量R-T-P-C-R分析的结果。

巨噬细胞在常规培养或微尺度培养体系中生长，并用大肠杆菌生物颗粒刺激一小时或四小时。蓝色柱表示常规培养细胞在刺激后基因表达的平均倍数增加，而红色柱表示在微尺度培养体系中生长并受到刺激的细胞的诱导表达水平。微尺度培养中的误差线表示三次独立实验中生物学重复之间的标准差。

基因表达谱结果非常相似，尽管传统培养使用的是96孔板，每孔约50,000个细胞，而微尺度培养使用的是微毛细管，每个灌注腔室约1000个细胞。实验间变异性至少与传统培养相当，通常在微尺度培养中更小，如较短的误差线所示。与传统实验相比，微尺度操作使细胞消耗减少了五倍，试剂消耗减少了三至五十倍。

该方法可用于培养几乎所有类型的贴壁细胞，某些情况下可使用不同的细胞外基质组分或培养基。非贴壁细胞类型的培养可能具有挑战性，但在类似条件下，细胞锚定策略已显示出成功效果。本文所述方法可支持微尺度培养长达24小时。

该平台还具备长期培养所需的所有功能，但需要开发细胞传代方案。可通过微毛细管互连结构将额外模块集成到数字微流控芯片中。通过这种方式，数字微流控系统作为中心枢纽，连接外围模块以执行复杂的实验流程。

我们主要致力于表征宿主对感染性病原体的转录响应，但该平台设计极为灵活，因此应能支持多种多样的研究应用。