一种简易的大豆原生质体分离方法及其在瞬时基因表达分析中的应用

本方法的总体目标是从大豆中获得高质量的原生质体细胞，以研究活体大豆细胞中的调控与信号传导机制。该方法有助于回答调控网络中的关键问题，例如其直接靶基因是什么、转录因子如何开启，以及其相互作用的蛋白伙伴是什么。该技术的主要优势在于其艺术性。

该方法能够大量制备均一的大豆原生质体细胞，且操作简便。通常，初次接触该方法的研究者可能会遇到困难，因为从小豆叶片中获得理想的原生质体非常困难，除非在特定时期进行单叶期处理。选择处于适当发育阶段的叶片是成功制备大豆原生质体的关键。

从10日龄的大豆幼苗上切取新展开的单叶。为确保在样品产生较高原生质体产量时具有代表性，应采集至少三个处于略微不同发育阶段的单叶样品。使用新的剃须刀片去除每片单叶的主脉，然后将剩余部分切成0.5至1毫米宽的条状。

用镊子将叶条轻轻转移至15毫升离心管中，管内含10毫升新鲜配制的酶溶液。在室温下对叶条进行真空渗透处理，持续15分钟。将叶条在酶溶液中于室温、弱光条件下轻轻振荡孵育4至6小时。

随着原生质体的释放，酶解液将变为黄绿色。在10倍物镜下通过显微镜观察酶解原生质体溶液，选择原生质体消化效果最佳的样品。释放出的原生质体呈球形，而未消化的细胞则呈不规则或椭圆形。

为了终止消化，将含有最佳原生质体消化效果的10毫升酶解原生质体溶液轻轻倒入50毫升离心管中，并加入10毫升室温的W5溶液。轻轻颠倒管子数次。然后，将酶解原生质体溶液缓慢倒入置于50毫升离心管上方的洁净75微米尼龙筛网上，以去除未消化的叶片组织。

接下来，在室温下以100 × g离心流穿酶解原生质体溶液1至2分钟。然后，用10毫升血清移液管轻轻吸去上清液，避免扰动原生质体沉淀。将原生质体重悬于预冷的W5溶液中，并将50毫升离心管置于冰上保存。

在显微镜下使用血细胞计数板计数原生质体数量后，用预冷的W5溶液将原生质体稀释至每毫升含2×10⁵个原生质体的浓度。将原生质体置于冰上静置30分钟。在室温下以100×g离心悬浮液1至2分钟。

然后使用1 mL移液器轻轻吸除W5溶液，注意不要扰动原生质体沉淀。在室温下，将原生质体重悬于MMG溶液中，浓度为每毫升2 × 10⁵个原生质体。为准备转化，使用未剪切的200 μL移液器吸头，将原生质体分装至1.5 mL低吸附微量离心管中，每管100 μL。

留出一份等分试样作为阴性对照。向其余的原生质体等分试样中加入 10 µL 质粒 DNA。沿 1.5 mL 微离心管内壁缓慢加入 110 µL 新鲜配制的 PEG 溶液。

然后轻轻倒置并旋转离心管，直至溶液均匀。将转化混合物在室温下孵育15分钟。为终止转化反应，于室温下向每个1.5毫升离心管中缓慢加入400微升W5溶液，并轻轻倒置离心管，直至溶液均匀。

在室温下以100 × g离心1至2分钟。弃去上清液。向每根试管中加入1毫升WI溶液。

使用六孔组织培养板时，需包被孔表面以防止原生质体粘附于板上。向每孔中加入1毫升5%无菌小牛血清，数秒后用移液器吸除小牛血清。将重悬的原生质体转移至培养板的各孔中，并用盖子盖好培养板。

收获前，将原生质体在室温下避光孵育两天。两天后，将原生质体溶液转移至1.5毫升低吸附微离心管中。在室温下以100 × g离心1至2分钟。

用移液器吸除上清液。取10 µL原生质体滴加到载玻片上。以未转化的原生质体作为阴性对照，在荧光显微镜或共聚焦显微镜下观察荧光信号。

从10天龄大豆的不同器官制备原生质体细胞，并在显微镜下进行观察。下胚轴和上胚轴的细胞壁几乎难以消化，且部分细胞仍相互粘连。

在尾部的根和根部，仅小部分细胞的细胞壁被去除。相比之下，使用单叶时观察到大量原生质体。本照片中的幼苗从左至右分别展示未展开、刚展开和完全展开的单叶叶片。

尽管未展开和刚展开的单叶均能获得较高产量的原生质体，但刚展开单叶的原生质体大小比未展开单叶更均一。对于完全展开的单叶，大多数细胞的细胞壁仍保持完整。测试不同浓度的质粒DNA表明，较高的DNA用量可导致更高的转化效率。

表达GFP与豆科特异性E1基因融合蛋白的载体转化大豆原生质体的共聚焦显微图像显示，E1-GFP融合蛋白定位于细胞核，这与先前利用拟南芥原生质体系统的研究结果一致。在进行该实验操作时，需注意根据实际情况经验性地优化各项实验条件，例如选择合适发育阶段的叶片材料、细胞壁消化时间的长短、原生质体的浓度与培养时间，以及用于转化的质粒DNA用量。在完成该实验步骤后，还可进一步采用RNA和蛋白质检测等其他方法，以回答更多相关问题，例如哪些基因或哪些蛋白质的表达被上调或下调。

观看本视频后，您应充分了解如何获得高质量的大豆原生质体细胞。