利用脱细胞小鼠肺和原代人内皮细胞移植生物工程化肺

生物工程化构建人体尺寸的器官需要大量资源，这通常超出了学术实验室的承受能力。降低迭代性实验方案开发的成本将加速该领域的研究进展。本研究旨在提供一种利用小鼠心肺组织块进行肺脏生物工程化的标准化操作流程。目前尚不清楚哪些细胞适用于器官生物工程化，以及这些细胞应如何整合到器官生物反应器培养系统中。为了建立可扩展且可重复的实验方案，需要对多种类型的细胞及培养条件进行比较。

小鼠体型小且易于操作，是常用的实验动物。然而，尽管其体型较小，哺乳动物肺部的基本结构具有相似性。通过在此小型平台上优化实验方案，我们只需根据动物体型按比例放大优化后的参数，即可将其扩展应用于其他激光动物模型。这种适用于小鼠肺部的生物工程平台，使研究人员能够高效地测试其干细胞。这些经过基因修饰的细胞在全肺工程中可能十分珍贵或成本较高。此外，还可利用患者来源的细胞在体外构建疾病模型。

目前的研究工作包括测试多种类型的工程化干细胞和祖细胞，以确定肺部生物工程所需的增殖潜能和分化能力。一旦确定了合适的细胞类型，该研究将扩展到更大的动物模型，例如猪。

[旁白] 首先，将已实施安乐死的小鼠仰卧位放置于手术台上，并固定四肢。用70%乙醇均匀喷洒胸部和腹部表面以进行消毒。接着，使用不锈钢剪刀沿中线切开腹腔并延伸至颈部，剪开胸骨。将膈肌从胸壁上分离。剪开胸骨前壁以暴露胸腔，并移除胸腺。使用4/0丝线结扎下腔静脉和右上腔静脉。用不锈钢剪刀剪断腹主动脉以进行引流。使用配备27号针头的5毫升无菌注射器，通过穿刺心室壁向右心室注入3毫升无菌PBS。用Dumont镊子将4/0丝线环绕主肺动脉打结。接着，使用弹簧剪在肺动脉瓣下方剪出一个2毫米的窗口，以进入右心室壁。将肺动脉导管经此窗口插入，并用预先打好的4/0丝线固定。使用5毫升注射器通过肺动脉导管缓慢注入2毫升PBS。将气管插管插入气管，并用4/0丝线结扎固定。现在，使用一个空的5毫升注射器通过气管插管缓慢注入2毫升空气。保持10秒，确保肺部无空气泄漏。取出心肺组织块。随后，将切除的心肺组织块转移至一个直径为10厘米的塑料培养皿中，其中盛有去离子水，用于肺组织的脱细胞处理。将组织块在4°C下孵育1小时。孵育结束后，使用5毫升注射器通过气管插管注入2毫升无菌去离子水，重复三次。每次注射后暂停片刻，使液体随肺组织回缩而排出。同样地，通过肺动脉导管注入2毫升水。向气管插管和肺动脉导管中各注入2毫升0.1% Triton X-100溶液。将心肺组织块转移至培养皿中，并在4°C下静置孵育Triton X-100溶液过夜。次日，为去除肺内残留的Triton X-100溶液，向气管插管和肺动脉导管中各注入2毫升去离子水，随后重复注入2毫升2%脱氧胆酸钠溶液。去除脱氧胆酸钠溶液后，向气管插管和肺动脉导管中各注入2毫升1摩尔氯化钠溶液。将心肺组织块孵育1小时。用去离子水去除氯化钠溶液后，向气管插管和肺动脉导管中各注入2毫升DNase I工作液。将心肺组织块继续孵育1小时。使用无菌PBS冲洗气管插管和肺动脉导管，以去除DNase I溶液。脱细胞完成后，确认肺组织边缘呈白色且透明。向玻璃容器中加入70毫升内皮细胞生长培养基2（EGM-2），然后盖上硅胶塞密封容器。将硅胶塞、玻璃容器、带管路的GL45螺口盖、250毫升可高压灭菌的玻璃瓶以及带鲁尔接头的L/S 14管路通过三通旋塞组装连接。将20号针头插入GL45螺口盖的硅胶隔膜中。使用连接在旋塞1和旋塞3上的10毫升注射器，向管路A、B和C中充满培养基。通过鲁尔接头将脱细胞后心肺组织块的肺动脉导管连接至管路C。确保导管和管路中无气泡存在。为实现内皮细胞的重力驱动灌注，将含有脐静脉内皮细胞（HUVECs）的细胞储液罐置于磁力搅拌器上，并确保储液罐高于器官腔室30厘米。将磁力搅拌器调至120转/分钟并开启。打开旋塞1和旋塞2，使细胞悬液经由管路A、管路C和肺动脉导管流入脱细胞支架中。进行器官培养灌注时，将器官腔室放入二氧化碳培养箱中。将管路B连接至脉动泵的泵头。关闭培养箱玻璃门，确保管路正确地位于门与橡胶密封圈之间。将脱细胞支架在37°C下孵育3小时，使内皮细胞在支架内充分沉降。启动泵，设定转速为6转/分钟，通过L/S 14管路实现每分钟2毫升的培养基灌注。观察脱细胞肺组织因培养基灌注而轻微扩张。随后关闭培养箱门。进行换液操作时，先停止泵的运行。将一个50毫升无菌注射器连接至旋塞3，从腔室中抽出50毫升培养基。另取一个50毫升无菌注射器，装入50毫升预温的培养基。将该溶液注入玻璃容器中，并通过旋塞3将培养基转移至腔室，注意正确切换旋塞方向。重新启动脉动泵。在灌注培养两天后，收获再细胞化的心肺组织块。脱细胞后的小鼠肺组织呈现白色半透明状态，表明细胞成分已被清除，同时保留了整体肺结构。组织学分析显示，脱细胞小鼠肺组织中肺泡结构完整，无残留细胞成分。在灌注式生物反应器培养两天后，接种三次10的7次方个HUVECs的再细胞化小鼠肺组织中，HUVECs分布均匀。HUVECs迁移至外周肺泡区域，形成类似毛细血管的网络结构，这在再细胞化肺组织中可被观察到。