由脱细胞肺切片制备的工程化肺组织

该方案可实现完整肺细胞外基质作为三维组织培养基质的重复利用，并具备中等通量。工程化肺组织系统的主要优势在于其平台的灵活性。ELTs 可根据需要适配不同的组织支架、细胞或培养基。

肺脏取出后，用一个10毫升注射器吸取琼脂糖和不含酚红的HBSS。通过气管套管向肺脏注入约10毫升空气，使肺膨胀，然后立即通过同一气管套管注入配制好的琼脂糖，直至肺叶最远端完全膨胀。使用三通阀的白色帽盖连接气管套管的雌性鲁尔锁接口，封闭气管。

将肺组织置于冰上的150毫米培养皿中，使琼脂糖凝固。根据论文中的方案制备肺组织切片，然后在100毫米培养皿中加入1/3体积的PBS。用镊子将包埋盒和标签转移至培养皿中。

如果切片处于冷冻状态，需逐个解冻，方法是加入室温的磷酸盐缓冲液（PBS）。然后将解冻后的切片转移至一个150毫米的培养皿中。使用精细镊子或止血钳轻轻展开切片，并小心吸除组织周围的过量PBS。

然后，用剃须刀片紧贴培养皿，沿其全长用力按压并轻轻左右摇动，从切片上切下一宽约三毫米、长度至少九毫米的组织条。将组织条装入包埋盒时，先使其漂浮在包埋盒上方，仔细居中对齐，确保组织两端略微伸出夹片上的孔洞。用精细镊子将一个标签部分插入一端的孔中，轻轻拉直组织，再固定第二个标签。

最后，使用镊子将每个标签完全压紧，以固定组织。夹紧所有侧边后，将装有包埋盒的100毫米培养皿转移至超净台中。使用弯头止血钳夹住带缺口的一侧，将包埋盒转移至含有第一种脱细胞溶液的六孔板中。

然后，将六孔板置于30 RPM的摇床上，振荡10分钟。吸去每孔中的液体，每孔加入3毫升第二种脱细胞溶液。将六孔板置于30 RPM的摇床上，孵育5分钟。

按照文稿中脱细胞化方案所述，依次对每种溶液重复此步骤。用 PBS 最终冲洗后，将组织转移至含有新鲜 PBS（含抗生素和抗真菌剂）的无菌六孔板中，在 37 摄氏度孵育 48 小时。经抗生素和抗真菌剂灭菌后，肺组织支架可立即接种细胞，或在 4 摄氏度保存长达 30 天。

在用于培养之前，将保存于4摄氏度的支架与新鲜的PBS以及抗生素和抗真菌剂一起，在37摄氏度下孵育过夜，作为额外的灭菌步骤。然后，用无菌PBS以每孔5毫升的量清洗支架，每次5分钟，共清洗三次。在5倍放大倍数的相差显微镜下检查支架，以选择适合接种的组织。

用内皮细胞培养基制备内皮细胞悬液，浓度为每毫升500万个细胞，并准备足够数量的细胞，以每片支架接种50万个内皮细胞。将经高压灭菌的接种浴置于100毫米的培养皿中，并小心地将冲洗后的支架倒置转移至接种浴中。轻轻涡旋混匀已制备的细胞悬液。

然后，使用移液器小心地将 100 µL 细胞悬液直接加至每个孔底部组织的上方，注意避免移液器枪头损伤组织。将接种了细胞的组织转移至细胞培养箱中。内皮细胞接种 24 小时后，使用手动移液器向每个孔中加入 900 µL 预先温育的培养基，然后将培养板放回培养箱中。

细胞接种24小时后，吸除培养基，并为每孔更换1毫升新鲜的内皮细胞培养基。接种肺泡内皮细胞72小时后，使用血细胞计数板对AEC2（肺泡上皮II型细胞）和成纤维细胞进行计数，并用AEC2生长培养基制备浓度为每毫升500万个细胞的1:1细胞悬液。用移液器吸出每个接种孔中的培养基，然后轻轻混匀已制备的细胞悬液。

用移液器将100微升细胞直接加到每个孔底部组织的上方。将接种了细胞的组织转移至细胞培养孵育箱中。两小时后，向每个孔中加入900微升预热的AEC2生长培养基，然后将培养板放回孵育箱。

在与AEC2细胞和成纤维细胞共培养24小时后，按每孔每插件加入一毫升预热的AEC2生长培养基，准备12孔板。用移液器从接种浴的每个孔中吸出800微升培养基，然后将插件从接种浴中取出，正面朝上转移至已准备好的12孔板中，每孔放置一个插件。在所需的培养期间内，每隔一天使用玻璃巴斯德吸管小心更换培养基。

在整个培养过程中，通过5倍放大倍数的相差显微镜监测组织再细胞化的程度。组织支架的苏木精和伊红染色显示，脱细胞后肺泡结构得以保留，且无可见的细胞核。在5倍放大倍数下通过相差显微镜观察脱细胞后的细胞外基质支架时，可见肺泡组织结构。

一些切片中还可观察到较大的分支气道和血管。培养第7天，相差显微镜显示，在成功再细胞化的案例中，工程化肺组织的再细胞化模式模拟了肺泡结构。再细胞化不良的情况也同样可见。

第7天或第8天的苏木精和伊红染色显示肺泡隔重新定植。免疫荧光染色显示存在I型前胶原α1阳性的成纤维细胞、ABCA3阳性的AEC2、CD31阳性的内皮细胞以及大量SPB阳性的AEC2。此外，胸苷检测显示许多AEC2处于增殖状态。

该技术促进了肺组织工程策略的发展，并推动了肺泡内支持Ⅱ型细胞增殖与分化的微环境研究。