跨膜结构域寡聚化倾向由ToxR检测法确定

以下实验的总体目标是研究蛋白质的跨膜区（TMDs）在天然膜环境中的成束化倾向。该目标通过在大肠杆菌中表达目标跨膜区来实现，该跨膜区与麦芽糖结合蛋白（用于定位至周质空间）及转录报告蛋白ToxR构建成融合蛋白。跨膜区诱导的成束化将导致ToxR二聚化，从而激活LXi的转录。第二步，裂解细胞并加入ONPG，后者被β-半乳糖苷酶水解为具有光吸收特性的产物——邻硝基苯酚（O-nitrophenol，ONP）。

接下来通过测量405纳米波长处的光吸收来定量ONP水平。为了确定跨膜结构域的水平，韧带化结果揭示了基于ToxR报告基因检测法的跨膜结构域的韧带化倾向。该技术相较于现有的生物物理方法（如SDS-PAGE或荧光法）的主要优势在于，跨膜结构域的行为是在大肠杆菌表达的天然磷脂双分子层中进行研究，而不是在去污剂胶束等膜模拟系统中进行。

该方法有助于解答膜蛋白研究领域中的一些关键问题，例如阐明跨膜螺旋关联过程中涉及的关键结构特征。在本实验方案开始之前，需利用商业合成的寡核苷酸制备七种表达所需嵌合蛋白的质粒，这些寡核苷酸代表感兴趣的TDS序列，其两侧分别为NHE1和BMH1限制性酶切位点。质粒制备完成后，将fhk12感受态细胞置于冰上轻轻解冻。解冻后，将细胞转移至15毫升培养管中，向每管分别加入200纳克质粒DNA，并将细胞置于冰上孵育30分钟。

然后在42摄氏度下对细胞进行90秒的热激处理，随后在冰上孵育两分钟，加入800微升SOC培养基，并在37摄氏度下振荡培养一小时。孵育后，取50微升转化混合物接种至5毫升含氯霉素的LB培养基中，每个样本设三个平行组，使用15毫升培养管。最后，在37摄氏度下振荡培养20小时。为检测TDS的完全连接化程度，测定β-半乳糖苷酶活性。

首先，将酶标仪预热至 28 摄氏度。按照书面实验方案所述，使用 Z 缓冲液原液配制新鲜的 Z 缓冲液溶液。将 Z 缓冲液氯仿从离心管转移至储液槽中，注意仅吸取 Z 缓冲液氯仿的上层水相层。

将96孔板放置在带有网格线的纸上，以确保移液准确；向96孔板的每个孔中加入100 µL Z缓冲液-氯仿，随后每个孔加入5 µL四联培养物。在作为阴性对照的四个孔中不加培养物。测定该板在595 nm处的OD值，以确定细胞密度。

向板的每个孔中加入 50 µL Z 缓冲液 SDS。然后在酶标仪中振荡培养板 10 分钟以裂解细胞，随后向所有孔中加入 50 µL ZPA 以启动 ONPG 反应。将培养板放回酶标仪中，每 30 秒测量一次 OD 405，持续 20 分钟。

通过计算经空白对照校正的Miller单位来确定β-半乳糖苷酶活性水平。通过Western blot验证不同构建体之间的蛋白质表达量是否相当。首先，合并三份培养物各50微升，然后使用微量离心机对样品进行离心。

用移液器吸除上清液并重悬。将残留的沉淀物悬浮于两倍体积的上样缓冲液中，每份样品取7.5 µL加样至标准8%凝胶，在125伏电压下电泳1小时5分钟。转膜后，将膜与抗M-V-P-H-R-P偶联抗体孵育，以检测嵌合蛋白；该蛋白大小约为70千道尔顿，有时在48千道尔顿附近可见部分降解产物。

内源性MVP也在45千道尔顿处被观察到。为了评估嵌合TMD结构的正确膜插入情况，当在以麦芽糖为唯一碳源的最低培养基中培养时，使用缺乏麦芽糖结合蛋白的PD 28细胞系：只有表达出具有正确位于周质空间的麦芽糖结合蛋白的膜整合表达产物的细胞才能生长。按照fhk 12细胞的操作方法转化PD 28细胞，并接种2毫升LB培养基。

孵育后，在37摄氏度、300 RPM 摇床条件下过夜培养细胞。通过离心收集细胞沉淀，并用2毫升 PBS 重悬，使用大口径枪头轻轻吹打洗涤。再次离心后，用 PBS 再次洗涤细胞一次，然后进行最后一次离心，并用1毫升 PBS 重悬细胞沉淀。

取25微升重悬的细胞接种到5毫升最小培养基中。在37摄氏度下振荡培养15小时。将每个样品的200微升转移至96孔板中，并使用酶标仪测定OD595读数。

每两小时重复此过程，直至25小时。利用ToxR转录报告基因检测法，分析了多跨膜整合膜蛋白——潜伏膜蛋白1中各个跨膜结构域的完全配体化倾向。跨膜结构域5表现出强烈的配体化倾向，其高Miller单位值可与阳性对照GPAA（一个已确立的二聚化序列）相媲美。

跨膜结构域五（D150A）中的一个有害突变会降低该序列完全激活LMP1的能力。TM1则不能显著激活，并表现出非常低的Miller单位信号，仅略高于空白对照（即未转化的FHK 12细胞）的信号水平。观看本视频后，您应能充分理解如何判断感兴趣的跨膜螺旋是否能够在天然膜环境中形成高级复合物。在进行该实验操作时，务必极其小心地将样品加入96孔板中，以避免产生较大误差，并确保不引入气泡。