蛋白水解靶向嵌合体（PROTACs）诱导三元复合物形成的生物物理检测方法的开发与应用

我们的研究重点是复制已建立的模型系统，通过额外的检测方法对其进行验证，并将这些方法学调整以适应我们特定的研究背景。我们旨在展示一种可广泛应用于各类项目的通用性方法。当前的实验挑战在于，如何根据项目的具体需求以及现有知识的空白，策略性地选择合适的检测形式和实验条件。

这对于在实验中获得高效且准确的结果至关重要。我们的实验方案为各种PROTACs系统的无缝适配提供了简化的操作流程。此外，我们对每种方法进行了全面评估，详细阐述了各自的优势与局限性。

我们将根据具体条件提供选择最适格式的指导建议。首先，准备用于细胞、注射器以及清洗的溶液。将蛋白质或缓冲液样品依次加入96孔板中的三个连续孔中。

现在，相应加入100% DMSO，使终浓度为2%。在微量热仪上进行全部四次滴定。每次滴定应包括一次初始注射：以每秒2微升的速度注入0.4微升蛋白质溶液，随后进行19次注射，每次以每秒2微升的速度注入2微升的注射器溶液，间隔122秒，共20次注射。所有实验均在25°C下进行，搅拌速度为600 RPM。

进行数据分析时，将数据拟合至单结合位点模型，以获得结合的化学计量比、解离常数以及结合焓。对VHL-MZ1二元复合物及VHL-MZ1-Brd4三元复合物进行了表征，观察到正协同效应。

在室温下使用链霉亲和素包被的传感器开始生物膜层干涉技术（BLI）实验。确保传感器静止排列成单行。将200 µL样品加入孔中。

接下来，将传感器浸入含有VHL的溶液中80秒，使传感器负载达到1-3纳米。随后，将传感器浸入缓冲液中60秒，以建立第一段基线期。在固定化阶段，将传感器浸入VHL蛋白溶液中80秒。

然后，再次浸入缓冲液中60秒，以建立第二个基线阶段。接着，浸入固定浓度的以下注射液中300秒。最后，将传感器再次浸入缓冲液中600秒，以建立解离阶段。

使用仪器软件分析数据，并估算结合速率、解离速率以及平衡解离常数。对VHL-MZ1二元复合物及VHL-MZ1-Brd4三元复合物进行了表征。研究发现MZ1可介导三元复合物的形成。

为进行VHL MZ1相互作用的表面等离子共振（SPR）实验，首先根据制造商说明书活化链霉亲和素芯片。配制最高浓度溶液时，向MZ1中加入无DMSO的缓冲液，以确保DMSO终浓度为2%。随后，将50微升最高浓度溶液移入含有100微升运行缓冲液的孔中。

充分混匀，以配制第二高浓度的溶液。然后取50 µL该溶液加入到下一管含100 µL运行缓冲液的离心管中。充分混匀，以制备第三高浓度的溶液，依此类推。

使用与聚丙烯微孔板兼容的自粘性透明塑料膜覆盖微孔板。采用多循环模式启动表面等离子体共振（SPR）检测。将检测模式设为高性能，接触时间为120秒，解离时间为300秒，流速为50微升每分钟。

使用仪器制造商提供的评估软件执行数据分析。为进行VHL MZ1 Brd4三元复合物的表面等离子体共振（SPR）实验，首先激活链霉亲和素，然后注入VHL溶液，使其固定化至约100共振单位。

对于仅使用 Brd4 的阴性对照，用 200 微升的运行缓冲液配制最高浓度为 25 微摩尔的溶液。向接下来的四个孔中各加入 160 微升浓度为 2 微摩尔的 Brd4。从第 A5 孔转移 40 微升至第 A4 孔，然后用移液器反复吹打混匀。

类似地，从 A4 孔转移 40 微升至 A3 孔，并继续此操作直至 A1 孔。为形成 MZ1 与 Brd4 的三元复合物，用移液器吸取 196 微升浓度为 25.5 微摩尔的 Brd4 溶液，向其中加入 4 微升用 100% DMSO 溶液配制的 20 微摩尔 MZ1。再用移液器将 160 微升浓度为 2 微摩尔的 Brd4 运行缓冲液加入左侧接下来的四个孔中。

接下来，从B5孔转移40微升至B4孔，并用移液器充分混匀。继续将溶液从每一孔依次转移，直至B1孔。现在运行SPR单循环实验，接触时间为100秒，解离时间为720秒，流速为50微升/分钟。随后对VHL-MZ1二元复合物以及VHL-MZ1-Brd4三元复合物进行了表征。

观察到正协同效应。使用表面等离子共振（SPR）对cereblon、PROTAC和PPM1D系统进行了表征。PPM1D实验采用镍NTA芯片，每次化合物注射后均对芯片表面进行再生。

BRD-2512 仅与cereblon结合，BRD-4761 仅与PPM1D结合，二者均表现出可忽略的结合反应。BRD-5110 可诱导PPM1D形成三元复合物，并在高化合物浓度下呈现钩状效应。