功能化线材基靶向细胞分离：一种从加标外周血中分离癌细胞的离体技术

上皮细胞黏附分子（EpCAM）是在前列腺癌快速增殖的上皮细胞中高表达的细胞表面跨膜糖蛋白。为分离表达 EpCAM 的细胞，首先使用带有经功能化处理的金涂层尖端的医用级导丝。功能化处理是在其表面包被一层聚合物凝胶，该凝胶共价结合了特异性针对 EpCAM 的抗体。

将导线浸入含有荧光标记癌细胞的外周血悬液中。确保导线的功能化部分始终浸没在血液悬液中。癌细胞表面的EpCAM识别并结合到导线表面功能化的特异性抗体上。

用缓冲液清洗以去除导线表面未结合的细胞。弯曲导线并将其固定在盛有缓冲液的载玻片上，使功能化部分浸入缓冲液中。使用荧光显微镜观察细胞质和细胞核的明亮荧光，确认导线上存在捕获的细胞。

用洗脱缓冲液处理导线。缓冲液中的蛋白水解酶可切割聚合物凝胶，使抗体-癌细胞复合物释放到缓冲液中。离心导线组件，使释放的抗体-细胞复合物沉淀至沉淀物中。移除导线及含有酶的上清液。将含有靶细胞的沉淀物重悬于适当的培养基中。

在5毫升外周血中，加入约500至500,000个细胞，然后通过倒置试管混匀。从储存室中取出金属丝后，移除固定金属丝的橡胶帽，将金属丝在1×磷酸盐缓冲液中清洗，并将其安装在试管盖上。随后，将试管置于倾斜的滚轴混合器上，在室温下以每分钟5转的速度孵育30分钟。孵育结束后，用1×磷酸盐缓冲液冲洗金属丝三次。然后，将金属丝置于含有1×磷酸盐缓冲液的15毫升试管中，避光保存。

使用记号笔在载玻片上画一个矩形区域，并向其中加入 500 微升 1× 磷酸盐缓冲液。为使导线的功能部分完全浸入 1× 磷酸盐缓冲液中，需将导线的非功能部分弯曲后放置在载玻片上。通过肉眼观察导线两侧，以计数捕获的细胞数量。观察完成后，将导线转移回含有 1× 磷酸盐缓冲液的 15 毫升离心管中，并置于避光环境中保存。

在1毫升1倍浓度的磷酸盐缓冲液中，溶解4毫克释放缓冲液组分。然后，将溶液通过0.2微米无菌滤膜过滤，得到可直接使用的缓冲液。接着，将释放缓冲液在37摄氏度下预热5分钟。预热后，转移1.6毫升释放缓冲液，完全填充一个1.5毫升的反应管。随后，将导线的功能部分置于37摄氏度水浴中，在释放缓冲液中孵育20分钟。

孵育结束后，将金属丝置于摇床中，以每分钟500转的速度振荡15分钟。然后在300 ×g条件下离心10分钟。离心结束后，将金属丝从离心管中移出，盖紧管盖，再于300 ×g条件下离心10分钟。