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为了在组织切片中可视化软骨和骨区域,首先准备一张载有目标小鼠胚胎冷冻薄组织切片的玻璃载玻片。
短暂解冻冷冻切片,并将其浸入适当浓度的乙醇中以去除冷冻包埋介质。此去除步骤有助于防止介质松动,否则可能影响染色过程中组织的观察。此外,乙醇可固定组织,维持组织形态和完整性。
接下来,将焦油紫溶液滴加到组织上。焦油紫是一种带正电荷的碱性染料,可与软骨组织基质中的多阴离子成分(如蛋白聚糖)结合。而在骨等矿化组织中,它则与骨基质中的磷酸基团等带负电荷的基团发生反应。
作为一种异染性染料,焦油紫会根据其与组织不同区域中各种化学成分的相互作用,将这些区域染成与其天然染料颜色不同的颜色。
现在,用适当浓度的乙醇洗涤组织以去除多余的染料。将组织浸入浓度递增的乙醇中,以置换组织中的水分,从而实现组织脱水。用二甲苯洗涤组织以取代乙醇,使组织透明,便于显微镜观察。
在光学显微镜下,软骨组织呈洋红色,而骨组织呈棕色,这有助于区分它们以及周围的组织。
准备三个已标记的50毫升离心管。向每个管中加入45毫升80%乙醇。将这三个管置于冰上。另将一个含有45毫升95%乙醇的管和一个含有100%乙醇的管置于冰上。接下来,在室温下向一个50毫升离心管中加入45毫升二甲苯。
将PEN膜载玻片置于戴手套的手上短暂解冻,然后在含有80%乙醇的离心管中振荡洗涤两次,每次30秒,以去除包埋剂(optimal cutting temperature compound)。随后,将载玻片平放在一张铝箔上。用移液器吸取0.8毫升含0.1%焦宁Y(cresyl violet)的50%乙醇溶液滴加到载玻片上,染色30秒。
将玻片浸入第三个含有80%乙醇的试管中清洗30秒。依次将玻片经95%乙醇试管中处理30秒、100%乙醇试管中处理30秒,最后放入二甲苯试管中处理30秒,以完成脱水。随后,将玻片置于洁净的擦拭纸上静置5分钟,使二甲苯流尽,并让组织切片自然干燥。