组织制备及小鼠颅面组织与未脱钙骨的免疫染色

本文介绍了我们在切片材料上进行蛋白质免疫荧光检测的简易实验方案。该方法无需抗原修复步骤。我们将使用包含未脱钙硬组织的小鼠头部样本。

该技术的主要优势在于无需进行抗原修复和硬组织脱钙。这有助于获得高质量的免疫染色结果。该方法还可节省时间和人力。

该方法经适当修改后也可适用于其他组织。若要从未经脱钙处理的组织中制备良好的切片，需进一步解剖目标组织以修剪周围组织，必要时在冷冻保护前于4°C条件下用10% EDTA处理样本两天。直观的演示可对该方法的操作步骤提供详细而清晰的说明。

首先，为每只怀孕小鼠准备一个10厘米和若干个3.5厘米的培养皿，内含PBS，另准备一个12孔细胞培养板，每孔加入2毫升含4%PFA的PBS溶液，并将所有器皿置于冰上。为从小鼠体内分离胚胎，用镊子夹住已处死小鼠腹部中央下方的皮肤，仅剪开皮肤，然后轻轻牵拉皮肤，使其与下方腹肌壁分离。沿皮肤切口方向，切开腹腔。

取出含有胚胎串的子宫，然后轻轻剪开子宫壁以分离胚胎，从而去除卵黄囊和羊膜等胚外组织。从每个胚胎上剪下头部，并用镊子将每颗头部分别转移至含有4%PFA的12孔板的各个孔中。

在 4 摄氏度下孵育 4 小时以进行固定。在 4 摄氏度下用 PBS 轻轻振荡清洗头部组织 12 小时。为进行冷冻保护，使用镊子将头部组织转移至新的 12 孔板中，孔板内含 2 毫升 PBS 配制的 30% 蔗糖溶液。

在4°C条件下轻轻振荡孵育，直至头部沉入培养皿底部。为包埋经冷冻保护的头部，将其转移至含有最佳切割温度化合物（Optimal Cutting Temperature Compound）的模具中，并平衡数分钟。使用镊子调整样品的位置和方向，使样品的修整面朝向包埋模具的底部。

然后将模具置于干冰上冷冻，并在准备进行冷冻切片前，存放在塑料袋中于负80摄氏度保存。对于出生后组织，在处死一只三周至三个月大的小鼠后，去除皮肤和脂肪组织，切下并分离头部，移除下颌骨。随后，按照与胚胎头部相同的方法对头部进行固定和冷冻保护。

以与OCT包埋胚胎头部类似的方法将样品包埋于8%明胶中，并将冷冻模具置于塑料袋内，在零下80摄氏度保存，直至进行冷冻切片。设置合适的冷冻切片机温度。将样品放入冷冻切片机腔室中，平衡约30分钟，使其达到冷冻切片机的温度。

从 Cryomold 中取出带有样本的组织块，用一滴 OCT 胶将组织块固定在样本头上并进行冷冻，确保样本修整面远离样本头且朝向操作者。将固定好组织块的样本头装入冷冻切片机的样品架中。调整刀片架，使刀片与样本之间的角度为三到五度。

将10微米厚的切片收集到包被的显微镜载玻片上。室温下放置至完全干燥，然后于-80摄氏度保存。开始染色前，从-80摄氏度取出载玻片，在室温下放置一小时，使切片自然干燥。

用0.1% PBST冲洗载玻片，每次5分钟，共冲洗三次，以洗去OCT并通透组织切片。每张载玻片加入200微升封闭液，在室温下孵育30分钟。然后，不冲洗载玻片，直接移除封闭液。

向每张切片中加入100微升用封闭液稀释的一抗，于4摄氏度孵育过夜。在室温下用PBS冲洗切片，每次10分钟，共冲洗三次。向每张切片中加入100微升用封闭液稀释的二抗，在室温下避光孵育1小时。

在室温下用 PBS 冲洗三次，每次 10 分钟，仍需避光。为封片，每张载玻片上加两滴含 DAPI 的抗荧光淬灭封片剂，加盖盖玻片，然后在 4 摄氏度保存，待成像时取出。对照组胚胎的额骨对 pSmad1/5/9（BMP 信号通路的下游因子）和细胞增殖标志物 Ki67 呈阳性。

然而，在神经嵴特异性的组成型激活BMPR1A突变胚胎中，pSmad1/5/9水平升高，而Ki67水平降低。此外，突变胚胎额骨中的凋亡细胞数量多于对照胚胎。经明胶包埋头部的冠状冷冻切片清晰显示鼻骨和鼻组织中来自tdTomato盒的GFP信号和RFP信号，表明明胶不会干扰荧光信号。

当对这些切片进行 SOX9 或 Osterix 以及 E11/Podoplanin 免疫染色时，大多数三周龄硬组织均获得了质量良好的切片。而相比之下，三个月龄样本中仅部分硬组织获得了质量良好的切片，包括股骨的骨小梁区域、鼻部组织以及头颅，特别是鼻前颌缝及其周围头骨结构。SOX9 阳性细胞特异性地存在于股骨和鼻中隔的生长板软骨细胞及关节软骨细胞中。

在三周龄的切牙中，SOX9 在间充质细胞中被检测到。Osterix 与 E11 的双重染色结果显示，Osterix 在股骨和头部骨骼的成骨细胞中被检测到，而 E11 在骨细胞中被检测到。在三周龄切牙中，Osterix 在成牙本质细胞中呈阳性，而 E11 在滤泡间充质细胞中呈阳性。

请勿使用4%PFA对样本进行过度固定。对于包埋于明胶中的未脱钙硬组织切片，最佳温度为零下25摄氏度或更低。按照本方案操作后，荧光水平可按照我们方案中所述方法进行定量。

这些测量将提供有意义的数据，以显示不同组间蛋白质相对水平的差异。该技术发展后，为进行双重或三重染色以获得不同蛋白质的共表达模式奠定了基础。4%PFA 具有危险性。

可能导致皮肤过敏、严重眼损伤、器官损伤或致癌。请使用个人防护装备，操作后彻底清洗皮肤。