无需标记的微管动力学干涉反射显微成像

干涉反射显微镜能够对动态生长和收缩的微管进行成像。

将石蜡条固定在一张盖玻片上，并在其上方放置一张略小的盖玻片。加热使石蜡融化，形成密封的通道。通过该通道加入含抗体的溶液。抗体将结合到盖玻片表面。随后加入封闭液，封闭未结合抗体的区域，防止非特异性蛋白结合。

将盖玻片放置在显微镜载物台上。设置样品加热装置的温度，以促进微管生长。

使用移液器操作以非水解型三磷酸鸟苷（GTP）类似物稳定的微管种子。这些种子会结合至抗体包被的盖玻片上。加入含有未标记微管蛋白、GTP 和还原剂的缓冲液。

在最适温度和缓冲条件下，种子作为成核位点，促进未标记微管蛋白的结合及微管的生长。

开始成像。入射光通过孔径光阑聚焦，照射到分光镜上，分光镜将部分光线反射至物镜，从而照亮样品。盖玻片的玻璃-缓冲液界面会部分反射入射光。剩余的入射光透过该界面，并在缓冲液-微管界面处发生反射。

根据微管与载玻片之间的距离，来自两个界面的反射光束会发生干涉，产生相长干涉——光束叠加形成明亮信号，或相消干涉——光束相互抵消形成暗信号。

以高对比度图像显示微管。采集延时图像，检测微管的生长与缩短。

首先，使用合适的滤光镜组，将一个50/50分光镜插入荧光显微镜的滤光轮中。操作时需小心处理分光镜，因其表面通常带有抗反射涂层。切换至高倍物镜，该物镜应同时具备高数值孔径。图中所示为一个100倍油镜，数值孔径为1.3。

接下来，使用刀片和载玻片作为直边，切割出宽度为 3 毫米的塑料石蜡膜条。将两条塑料石蜡膜条间隔 3 毫米放置在洁净的 22 × 22 毫米盖玻片上。然后，在膜条上方放置一个 18 × 18 毫米的盖玻片，以形成一个通道。

将盖玻片转移至100摄氏度的加热块上，持续10至30秒，使石蜡膜形成密封通道。使用移液器通过灌注加入50微克/毫升的抗罗丹明抗体，并将载玻片孵育10分钟。

孵育结束后，使用过滤的 BRB80 溶液冲洗通道五次。然后加入含 1% poloxamer 407 的过滤 BRB80 溶液，以阻断表面的非特异性结合，并将载玻片孵育 10 分钟。再次使用过滤的 BRB80 溶液冲洗通道五次。

为防止样品干燥，在通道两端各加入两滴过滤后的BRB80缓冲液，并根据需要补充缓冲液。将样品置于显微镜载物台上，打开落射照明光源。先聚焦于石蜡膜边缘以找到样品表面，然后移动视野，将观察区域调整至腔室中央。由于光路中光学元件对光的反射，当物镜上下移动时，您会观察到多个反射面。

接下来，通过将视场光阑关闭一半并使用调节螺丝将其居中。光阑对准后，重新打开光阑。然后推入伯特兰透镜以观察物镜的后焦平面，即物镜的出瞳。

关闭孔径光阑，使其边缘超出出射光瞳的边缘，然后使用调节螺钉将孔径光阑相对于出射光瞳居中。通过打开孔径光阑并使其边缘与出射光瞳的边缘对齐，再次检查对中情况。随后，将孔径光阑设置为物镜数值孔径的约三分之二。

使用脑源性微管蛋白对微管动态进行成像时，首先将样品加热器温度设置为 37 摄氏度。用移液器加入 10 微升 GMPCPP 稳定的微管种子，并通过实时成像观察其与表面的结合情况。当视野内有 10 至 20 个种子结合后，使用预热并过滤的 BRB80 缓冲液以两倍通道体积冲洗样品。

接下来，注入10 µL聚合反应混合液。

为测量微管生长，使用采集软件设置时间序列，每5秒采集一次图像，持续15分钟。通过在每个时间点采集10张图像并生成平均图像来增强对比度。按照前一节所示方法采集背景图像。依次点击图像、堆栈、Z 投影，选择中值以计算中位数。依次进入处理、图像计算器，在下拉菜单中选择减去，以减去相应的背景。确保勾选32位浮点结果选项。

对于微管收缩实验，将时间延迟设为零，并保持曝光时间为10毫秒，以每秒100帧的速度采集图像。