无标记、高速微管成像的干涉反射显微镜技术实现

本方案的意义在于引入了一种无标记成像技术，该技术能够以高帧率获取高对比度图像，且相较于微分干涉（DIC）和暗场等其他技术更为简单、经济。该技术的主要优势在于易于实施和操作，成本低廉，并可轻松与荧光显微镜结合使用。

该方法旨在用于观察单个微管结构，也有望用于观察大型蛋白质复合物和纳米颗粒。主要难点在于需要较高的活化能来调整滤光立方体，以添加半镀银镜。

对于首次尝试该技术的人，我的建议就是动手去做。首先，使用合适的滤光片组，将一个50/50分光镜插入荧光显微镜的滤光轮中。操作时需小心处理分光镜，因为其表面通常带有抗反射涂层。

切换至高倍物镜，该物镜应同时具备高数值孔径。此处所示为一个100倍油镜，数值孔径为1.3。接下来，使用剃须刀片和载玻片作为直边，切割出宽度为三毫米的塑料石蜡膜条。

在洁净的 22 × 22 毫米盖玻片上，将两条塑料石蜡膜条平行放置，间距为 3 毫米，然后将一块 18 × 18 毫米的盖玻片置于膜条上方，形成一个通道。将该盖玻片转移至 100 摄氏度的加热块上，加热 10 至 30 秒，使石蜡膜熔化并形成密封通道。使用移液器通过灌注方式加入浓度为 50 微克/毫升的抗罗丹明抗体溶液，并将载玻片孵育 10 分钟。

孵育结束后，使用过滤的BRB80溶液冲洗通道5次，然后加入含1%泊洛沙姆407（Poloxamer 407）的过滤BRB80溶液，以阻断表面非特异性结合，并将载片孵育10分钟。再次使用过滤的BRB80溶液冲洗通道5次。为防止样品干燥，在通道两端各加入两滴过滤的BRB80溶液，并根据需要补充缓冲液。

将样品置于显微镜载物台上，打开落射照明光源。先聚焦到石蜡薄膜边缘以找到样品表面，然后移动视野，使观察区域位于腔室中央。由于光路中光学元件对光的反射，当物镜上下移动时，您会观察到多个表面。

接下来，通过将视场光阑关闭一半并使用调节螺钉，将其居中于视野中。当光阑正确对齐后，重新将其打开。然后推入伯特兰透镜，以观察物镜的后焦平面，即物镜的出瞳。

关闭孔径光阑，使其边缘超出出射光瞳的边缘，并使用调节螺钉将孔径光阑相对于出射光瞳居中。通过打开孔径光阑并使其边缘与出射光瞳的边缘对齐，再次检查对中情况。然后，将孔径光阑设置为物镜数值孔径的大约三分之二。

首先，将相机的曝光时间设置为10毫秒，并调节光照强度，使其接近饱和相机的动态范围。接着，使用移液器加入10微升GMPCPP稳定的微管蛋白，溶于0.22微米过滤的BRB80缓冲液中。监测微管在成像表面的结合情况。

当视野中有10至20根微管结合后，用过滤的BRB80缓冲液洗涤样品两次。通过设置时间序列采集10张微管图像，曝光时间为10毫秒，间隔1秒，总时长为10秒。随后，在使用载物台控制器沿通道长轴移动载物台的同时，连续采集100张无延迟的背景图像。

使用脑源性微管蛋白对微管动态进行成像时，首先将样品加热器温度设置为37摄氏度。用移液器加入10微升GMPCPP稳定的微管种子，并通过实时成像观察其与表面的结合情况。当视野内有10至20个种子结合后，使用两倍通道体积的预热并过滤过的BRB80缓冲液洗涤样品。

接下来，加入10微升聚合反应混合液。为测量微管生长，使用采集软件设置时间序列，每5秒采集一次图像，持续15分钟。在每个时间点采集10张图像并进行平均，以增强对比度。

获取背景图像，方法如前一节所示。依次点击图像、选择堆栈、Z 投影，然后选择中值，以计算中值。通过依次点击处理、图像计算器，在下拉菜单中选择减法，减去相应的背景。

确保选中32位浮点结果选项。对于微管缩短的观察，通过将时间延迟设为零并保持曝光时间为10毫秒，以每秒100帧的速度采集图像。使用干涉诱导显微镜获取高对比度图像的一个重要因素是正确设置照明的数值孔径。

这可以通过调节照明光束在物镜出射光瞳处的尺寸来实现，而该尺寸由孔径光阑的大小控制。使用荧光标记的稳定微管样品，在荧光成像的同时，通过显微镜的调焦旋钮将微管调至清晰对焦。将相机曝光时间设为10毫秒，并将孔径光阑关闭至最小开孔。

此外，调节照明至接近饱和相机的动态范围，或直至达到最大值。通过连续采集包含10条或更多微管的视野图像，获取10幅图像。然后采集一幅背景图像。

调整虹膜光阑的大小，并调节光照强度以匹配先前确定的条件。采集10张新图像和一个新的背景图像。重复此过程，直至完成虹膜光阑的整个调节范围。

针对获取的每个视野，减去相应的背景，并对所得的背景校正图像进行平均，方法如前所述。然后，计算每种孔径大小下微管的平均信号与背景噪声比。将光圈大小设置为产生最高信号与背景噪声比的数值。

可能存在一个尺寸范围，均可产生与此处所示相当的对比度。使用校准良好的显微镜时，应无需背景扣除即可观察到微管。然而，扣除背景确实能够增强微管的对比度。

为进一步增强对比度，可采用平均化、4a滤波或二者结合的方法。此处展示的线扫描结果描述了图像质量的逐步提升，每一步处理均显著降低了背景噪声。

微管动态可通过时间推移电影生成的运动图（kinograph）来报告。此处展示了一个以每秒0.2帧的帧率采集的运动图示例。虚线标记了成核位点（seeds）。

进行此操作时，使用高数值孔径的物镜非常重要。同时，正确对齐并设置孔径光阑直径的大小也至关重要。可将干涉反射显微镜（IRM）与荧光成像结合使用，以研究微管结合蛋白及其对微管动力学的调控作用。

该技术显著降低了光损伤，并支持更高帧率的图像采集，从而更易于长时间研究标记的生物大分子（如微管），实现高时间分辨率和良好的追踪精度。