可视化宿主内皮细胞内吞的厌氧细菌

从处于活跃生长期的厌氧致病菌Porphyromonas gingivalis悬液开始。

加入BCECF-AM，一种非荧光性、可渗透细胞的染料。

活化的细胞质酯酶将染料水解为一种荧光性、不可透过细胞的形态，从而对细菌进行染色。

离心。在厌氧培养基中重悬细菌。

将标记的细菌加入多孔板孔中，孔内含有贴壁的人脐静脉内皮细胞的盖玻片。

在厌氧环境中孵育。

细菌菌毛与内皮细胞表面受体结合，启动细胞内信号转导级联反应。

这会导致肌动蛋白重排以及细菌在吞噬体内的内化。

孵育结束后，用缓冲液洗涤盖玻片，以去除未被内化的细菌。

使用多聚甲醛固定细胞，以保存细胞结构。利用非离子型去污剂对细胞进行透化处理，以便接触细胞内靶标。

加入荧光标记的鬼笔环肽，其可结合肌动蛋白丝。

将盖玻片置于含有 DAPI 的封片剂上，DAPI 可用于染色 DNA。

观察荧光 Porphyromonas gingivalis 在表达荧光肌动蛋白的内皮细胞内，证实细菌已被内化。

为了观察被内化的细菌，首先将经高压灭菌的玻璃盖玻片无菌转移至12孔板的每个孔中。每孔接种5 × 10⁴个HUVEC细胞至盖玻片上，并培养24小时。为标记细菌，离心处于对数中期的细菌，用厌氧PBS重悬菌体沉淀，再次离心，并重复洗涤步骤。

向2 mL厌氧PBS中加入20 µL 0.2 mmol/L BCECF-AM，其中含有每毫升5至7×10⁸个细菌。在37°C避光孵育30分钟。

我们使用的荧光染料可以对大多数厌氧菌进行染色，因此无需其他试剂（如特异性抗体）。

在5,000 × g 条件下离心细菌悬液10分钟，以去除未结合的标记试剂，并将细菌重悬于VEGF培养基中。然后以100:1的细菌与细胞比例感染HUVEC细胞，在37°C孵育30分钟。孵育结束后，移除感染培养基，并用PBS洗涤细胞三次。随后加入4%多聚甲醛，在室温下于厌氧室中孵育10分钟，以固定细胞。

取出固定后的细胞，然后用 PBS 清洗盖玻片三次。将盖玻片置于 1 毫升 0.2% Triton X-100 中孵育 10 分钟，以通透细胞。随后，用 PBS 再次清洗盖玻片三次。接着，向每张盖玻片上加入 50 微升浓度为 50 微克/毫升的 TRITC 标记鬼笔环肽，室温孵育 45 分钟，以染色细胞内的寡聚肌动蛋白。

孵育后，用 PBS 洗涤盖玻片三次。将盖玻片倒置在载玻片上，使用含有一微克每毫升 DAPI 的软封 mounting 介质进行封片，以实现细胞核染色。然后用指甲油封固盖玻片边缘，于共聚焦显微镜下观察。