牵引力显微镜与微流控技术结合用于趋化性集体迁移

集体细胞迁移通常由信号分子的浓度梯度引导。在本视频中，我们演示如何量化由生化梯度引导的集体迁移过程中的细胞受力。我们将微流控芯片与牵引力显微镜技术相结合，利用微流控芯片生成生化梯度，并通过牵引力显微镜测量细胞施加的力。

我实验室的博士后姜焕锡（Dr. Hwanseok Jang）将演示该操作步骤。按十比一的比例混合基础弹性体与固化剂，配制PDMS溶液。取15毫升基础弹性体置于50毫升锥形管中，加入1.5毫升固化剂。

准备两个这样的离心管。将PDMS混合物涡旋振荡五分钟，然后在196 ×g条件下离心一分钟以去除气泡。为了制备PDMS模板，将约一毫升PDMS混合物倒入晶圆上，注意避开SU-8图案区域，使PDMS接触SU-8柱的侧面，但不覆盖SU-8图案的顶部。

将晶圆置于平坦表面，在室温下静置超过30分钟，然后在80摄氏度的干燥烘箱中固化PDMS超过两小时。小心地将PDMS从SU-8模具上剥离，使用14毫米空心打孔器修剪薄PDMS膜。在对PDMS模板进行高压灭菌前，用粘性胶带去除PDMS片表面的灰尘。

制备PDMS微通道时，将约30毫升PDMS混合物倒入SU-8模具中。在真空腔内脱气30分钟，然后在80摄氏度的干燥烘箱中固化PDMS超过两小时。小心地将PDMS从SU-8模具上剥离，并将PDMS切割成24毫米×24毫米的尺寸。

使用1毫米活检打孔器在每个PDMS块上制作一个出口和三个入口。按照文本方案所述方法制备并硅烷化玻璃片。在底部玻璃片的边缘表面覆盖100微升结合硅烷溶液。

将玻片在室温下放置一小时后，用去离子水冲洗玻片三次。然后在室温空气中自然晾干，或用压缩空气吹干。按照文本方案中的描述配制聚丙烯酰胺凝胶溶液。

然后将10 µL混合凝胶溶液转移至矩形微孔中，并在其上方放置一个圆形盖玻片。用胶带将定制玻璃片、凝胶溶液和盖玻片的组装体固定在六孔板的盖子上，并将其翻转。随后在96 ×g 条件下离心10分钟，使荧光微粒迁移至聚丙烯酰胺凝胶的顶层。

从离心机中取出组装件，将其放置在平坦表面上，盖玻片朝下。30分钟后，翻转组装件并放入35毫米的培养皿中。向培养皿中加入2毫升去离子水。

用镊子轻轻将盖玻片向一侧滑动，小心移除。为在聚丙烯酰胺凝胶上交联胶原蛋白，将每毫升含1毫克的 sulfo-SANPAH 溶解于温热的50毫摩尔 HEPES 缓冲液中。取200微升该溶液滴加至凝胶表面，并用紫外光照射10分钟进行活化。

紫外光活化后，用 0.1 摩尔 HEPES 缓冲液冲洗凝胶两次，再用 PBS 冲洗一次。将聚丙烯酰胺凝胶在 4 摄氏度下用胶原溶液孵育过夜。次日，用 PBS 洗涤凝胶三次。

将灭菌后的PDMS模板浸入F-127溶液中，置于37摄氏度培养箱中孵育一小时。用PBS清洗PDMS模板三次，并将PDMS模板和聚丙烯酰胺凝胶上的液体去除。

然后将PDMS模板放置在聚丙烯酰胺凝胶上，并向模板中加入PBS。通过轻柔移液去除PDMS模板孔洞中的气泡。去除气泡后，清除PDMS模板表面的PBS。

现在将200微升细胞溶液加入PDMS模板上，并将凝胶置于培养箱中孵育1小时，使细胞贴附于聚丙烯酰胺凝胶表面。孵育结束后，用细胞培养基轻轻洗去细胞溶液，再加入新鲜的细胞培养基。移除PDMS模板，在显微镜下观察细胞岛的形成情况。

接下来，将PDMS微通道表面用氧气等离子体处理30秒。去除填充了聚丙烯酰胺凝胶的底部玻璃片上的任何液体后，将PDMS微通道置于底部玻璃片上方，并将组装件放置在定制的玻璃支架上。用细胞培养基填充微通道。

为准备集成微流控系统的进样管路，将一根截短的针头与一段30厘米长的微型管路通过一个三通旋塞连接。准备三套此类装置。对于出样管路，将一根截短的针头与一段75厘米长的微型管路通过一个三通旋塞连接。

将已预热一小时的培养基注入管路中。通过从注射器上取下活塞并连接进液管路来准备储液器。将每根管路的针头连接器插入微流控装置的三个入口和一个出口中。

向每个储液池中加入三毫升新鲜培养基或条件培养基。进行梯度测试时，在左侧入口储液池中加入含20纳克/毫升肝细胞生长因子（HGF）的细胞培养基。为可视化浓度梯度，向左侧入口储液池中添加200微克/毫升的荧光染料。

将出口管路连接至注射泵。将集成的微流控系统放置在常规落射荧光显微镜的载物台上。使用置于培养箱内的自动化显微镜，每10分钟拍摄一次图像，持续最长24小时。

在每个时间点，使用 4X 物镜在三个不同通道中拍摄一组图像，包括用于观察细胞迁移的相差图像、用于观察凝胶中嵌入的荧光微球的绿色荧光图像，以及用于观察化学物质浓度梯度的红色荧光图像。拍摄完延时图像后，向微通道中注入 0.25% 胰蛋白酶-EDTA 溶液，使细胞从聚丙烯酰胺凝胶上脱离。待细胞完全从凝胶上移除后，拍摄一张绿色荧光图像，作为牵引力显微镜分析的参考图像。

按照文中的实验方案进行数据分析。为了测量收缩力和细胞间应力，将牵引力显微镜技术与单层细胞应力显微镜技术结合微流控通道使用。应力图谱以极坐标形式绘制，其中向外的牵引力用暖色调表示，向内的牵引力用冷色调表示。

在零时刻，所有微岛均表现出相似的牵引力分布，边缘区域具有较强的向内牵引力，岛内区域则呈现波动状态。在施加HGF梯度10小时后，尽管各列微岛的扩张程度有所不同，但牵引力分布与零时刻基本相似。平均牵引力在10小时内未发生显著变化。

然而，在计算单层细胞应力时，各组显示出不同的趋势。在HGF浓度较低的情况下，细胞岛内的平均张力在10小时内维持在约200帕斯卡。而在HGF浓度较高的情况下，细胞岛内的平均张力在10小时内从230帕斯卡逐渐下降至100帕斯卡，与先前结果一致。

当微岛左侧的HGF浓度较高而右侧较低时，平均张力维持在约150帕斯卡。填充微流控通道时必须轻柔操作。在去除通道中被困气泡的同时，避免扰动微亲本细胞岛至关重要。

通过使用该集成系统，可以研究细胞集体如何在机械上响应各种化学梯度，例如趋化因子或生长因子。该平台将有助于我们进一步探索化学梯度下集体细胞迁移的力学机制，这对于理解组织再生、癌症转移和发育过程至关重要。