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$$\longrightharp{xx}$$,
从感染了病原性寄生虫的固定且通透的上皮细胞开始。
加入封闭缓冲液以防止非特异性抗体结合。
加入小鼠多克隆一抗,特异性结合寄生虫的蛋白质。
加入与寄生虫蛋白结合的初级抗体相互作用的远红荧光染料标记的次级抗体。
洗涤以去除未结合的抗体。使用抗小鼠抗体封闭可与一抗结合的位点,以减少宿主蛋白标记过程中的交叉反应性。
加入靶向上皮细胞内宿主核糖核蛋白的小鼠单克隆一抗。
加入绿色荧光染料标记的二抗与红色荧光染料偶联的鬼笔环肽混合液,分别用于标记与宿主蛋白结合的一抗和肌动蛋白。
用缓冲液洗涤。使用含有DNA染色剂的封片介质封片,使宿主细胞核、寄生虫核和动基体呈现蓝色。
使用共聚焦显微镜分析样品。双重标记免疫荧光技术可显示绿色的宿主蛋白和红色的寄生虫蛋白,从而实现其精确的亚细胞定位。
将LLC-MK2细胞加入含有经紫外线灭菌的圆形盖玻片的24孔板中,静置16小时。然后加入含有T. cruzi 的上清液以感染细胞,每孔加入适量上清液,孵育6小时。接着,用PBS将含有感染和未感染细胞的盖玻片洗涤5次。
然后,用2%多聚甲醛和PBS固定细胞。10分钟后,用PBS将盖玻片洗涤3次,每次5分钟,随后用非离子型去污剂对盖玻片进行10分钟的透化处理。
经过三次每次 5 分钟的 PBS 洗涤后,将盖玻片在封闭液中孵育 30 分钟,随后再与小鼠单克隆或多克隆抗体在封闭液中孵育 30 分钟。洗涤后,将盖玻片与二抗及鬼笔环肽在封闭液中共同孵育 30 分钟,以对宿主细胞中的肌动蛋白纤维进行染色。
然后,用 PBS 再次清洗盖玻片三次,再向载玻片表面加入少量含 DAPI 的抗荧光淬灭封片剂。使用镊子将盖玻片轻轻倾斜放入封片剂中,以避免产生气泡。
进行双重标记时,在按照前述方法孵育盖玻片并用封闭液处理后,将盖玻片与小鼠多克隆抗体在室温下孵育30分钟。接着,用PBS洗涤盖玻片三次,每次5分钟,然后与二抗孵育30分钟。
然后用 PBS 洗涤三次,再用封闭液稀释的 AffiniPure 兔抗小鼠 IgG 进行第二步封闭。30 分钟后,再次用 PBS 洗涤盖玻片,随后与小鼠单克隆抗体孵育 30 分钟。
接下来,经过三次 PBS 洗涤后,将盖玻片与山羊抗小鼠 IgG2b 抗体及鬼笔环肽共同孵育。随后,再经过三次 PBS 洗涤,按先前所示方法加入抗荧光淬灭封片剂。