人多能干细胞来源的分化神经元的重铺板

从一个含有大量人多能干细胞分化而来的神经元的大培养皿开始，这些神经元具有密集的神经网络。

用温和的蛋白水解酶孵育这些神经元，以将其从培养板上解离下来，整片掀起。

随着持续孵育，酶会部分破坏细胞间的连接，使神经元网络松解。

加入培养基以终止酶活性。

反复吹打已解离的神经元，使其彼此分离。

通过细胞筛过滤神经元，以去除细胞团块并收集单个神经元。

离心并去除上清液。在生长培养基中重悬。

进行传代时，将这些神经元接种到聚合物和黏附蛋白包被的多孔板上，孵育以促进其贴壁。

神经元利用培养基中的营养物质维持存活。需定期更换培养基以保持营养水平。

继续孵育以促进神经元成熟及其相互间连接的形成。

首先用 PBS 轻轻冲洗分化神经元的培养板。将 PBS 沿培养板壁分散加入，避免直接滴加到细胞上，以防扰动细胞。倾斜培养板，从培养皿边缘吸除 PBS，注意不要触碰细胞。

每10厘米培养皿中加入至少1毫升蛋白酶溶液，将细胞放回培养箱中孵育40至45分钟。孵育期间，在相差显微镜下观察神经元，持续进行蛋白酶消化处理，直至神经网络完全从培养皿表面脱离并开始解体。当神经元完全脱离后，按每1毫升蛋白酶加入5毫升新鲜DMEM培养基的方式终止消化反应。

使用血清移液管轻轻吹打细胞，沿培养板反复吹打5至8次，注意不要施加过大压力。将细胞通过100微米滤网逐滴滤入50毫升锥形管中，并用额外的5毫升新鲜DMEM培养基冲洗滤网。

使用台式离心机以 1,000 × g 的离心力离心 5 分钟，使细胞沉淀。离心结束后，将锥形管放回生物安全柜中，吸除大部分培养基，保留 250 微升以保持细胞湿润。用 2 毫升新鲜 DMEM 培养基轻柔重悬细胞，并通过 5 毫升血清移液管的管口吹打混匀。

最后，将离心管轻轻颠倒2至3次。使用血细胞计数板和台盼蓝对活细胞进行计数，然后用新鲜DMEM将细胞稀释至所需浓度。根据特定细胞系的需求向管中加入适当的添加剂，并通过倾斜锥形管2至3次轻轻混匀细胞。

从24孔板中吸出层粘连蛋白包被液，并用PBS洗涤一次。吸除PBS，然后以“8”字形方式将细胞悬液加入各孔，以避免细胞聚集成团。细胞接种完成后，将培养板放回设定为37摄氏度和5%二氧化碳的培养箱中。