通过单链退火法在Saccharomyces cerevisiae中定量与分析HO内切酶诱导的染色体易位的形成

本实验的总体目标是通过单链跪曲（kneeling）在二倍体出芽酵母细胞中确定易位形成过程中的遗传调控机制。首先，用特定基因型的单个菌落接种培养物，并过夜培养。实验的第二步是通过向培养物中添加半乳糖，利用 HO 内切酶在两条染色体上同时诱导产生双链断裂。

接下来将这些培养物进行系列稀释，并涂布于选择性与非选择性培养基上。最后一步是通过计数选择性与非选择性培养基上形成的菌落，确定易位频率。最终可获得结果，显示单链在不同基因型菌株中通过改变热激诱导的易位形成频率，对易位形成具有遗传调控作用。

该技术的意义延伸至癌症患者接受治疗性辐射暴露后的后果，因为DNA双链断裂和易位形成是该治疗的主要后果。开始进行确定HO诱导的易位频率的操作时，用目标基因型的单菌落接种10至20个独立的1毫升YPD甘油乳酸培养基培养物，在30°C下于旋转摇床上过夜培养。当培养物达到所需细胞密度时，向培养物中加入20%半乳糖，使其终浓度为2%。半乳糖将诱导HO内切酶的表达，该酶会在3号染色体上的his3δ5′等位基因和15号染色体上的his3δ3′等位基因处引发双链断裂，在30°C下于旋转摇床上继续孵育4小时。

下一步对于实验的成功至关重要。必须仔细进行培养物的稀释与涂布。若要获得足够可重复的移位频率，以便在不同基因型菌株之间进行具有统计学意义的比较，则在培养四小时后，应将适当稀释度的培养物分别涂布于不含组氨酸的培养基以及YPD培养基上，每皿约100至200个菌落，于30°C培养两至三天。

当菌落形成后，可确定易位频率。通过比较内切酶 ho 表达诱导前后菌落的形成效率，可判断任一易位染色体的存在或缺失是否影响细胞在双链断裂（DSB）形成后的存活能力。为确定诱导前的菌落形成效率，需对 3 号染色体和 15 号染色体的各一个拷贝进行片段化处理。

首先，从每种过夜培养物中取出一份等分试样，通过血细胞计数板计数确定细胞数量。接着，使用适当的稀释倍数，将约100至200个细胞涂布于YPD培养基上，在30°C下培养两至三天，直至菌落出现。向剩余的培养物中加入20%的半乳糖，使其终浓度为2%，并在30°C下继续孵育4小时，以测定诱导后的涂布效率。

诱导四小时后，从每种培养物中取出一份细胞等分试样，使用血细胞计数板计数，通过适当稀释后在YPD平板上计数约100至200个细胞，于30°C培养两至三天，直至菌落出现。一旦平板上出现菌落，即可确定涂布效率。可通过Southern印迹分析携带假定易位的克隆。

该实验流程采用从每次独立实验中获得的一个hiss阳性重组菌落中提取的基因组DNA，分别取约四微克每种DNA样本，用BAM H I限制性内切酶进行消化，将BAM H I消化后的片段在0.7%琼脂糖凝胶上进行电泳分离，随后转移至带正电荷的尼龙膜上，使用通过随机引物法标记的P 32探针进行杂交，该探针来源于含有HIS3基因的1.8千碱基BAM H I基因组克隆。通过放射自显影或磷屏成像技术检测DNA片段。另一种分析潜在易位阳性克隆的方法是染色体印迹分析。

首先从所选的hiss阳性重组子中制备染色体，将染色体在1% aros凝胶中通过脉冲场凝胶电泳（CHEF）于14摄氏度下进行分离。使用的电泳参数如下：第一阶段，14摄氏度，脉冲时间为72秒，6伏特/厘米，持续15小时；第二阶段，14摄氏度，脉冲时间为122秒，6伏特/厘米，持续11小时。电泳完成后，将凝胶用AUM溴化物染色30分钟，随后用紫外光照射，并用蒸馏水漂洗。通过毛细作用将染色体转移至带正电荷的膜上。

在变性条件下，使用通过随机引物法标记的 P 32 探针进行杂交，该探针来源于包含 hiss 基因的 1.8 千碱基 bam H 一至 bam H 一片段的基因组克隆。通过自显影或磷屏成像技术观察染色体。染色体易位频率可通过将组胺光营养型菌落的数量除以在 YPD 培养基上涂布测定的活细胞总数来计算。

在此示例中，计算得到的重组频率约为 3%。可通过使用不同基因型的菌株进行检测，以比较其通过单链修复双链断裂的能力差异。如本代表性图表所示，无论是在诱导前还是诱导后涂布条件下，RAD51Δ 纯合缺失突变株在选择性和非选择性条件下获得的易位频率，均与野生型菌株相应条件下的结果存在统计学上的显著差异。

效率通过将培养物中可形成菌落的活细胞总数除以血细胞计数板计数确定的细胞总数来计算，如本表中诱导前后涂板结果所示。野生型细胞的效率差异无统计学意义，表明任一易位染色体的存在或缺失均不影响细胞在双链断裂形成过程中的存活能力。

可通过基因组Southern印迹分析来检测携带易位的克隆。此处展示了易位形成前后相关染色体的图示。通过BAM H I消化亲本和重组菌株的基因组DNA，并利用1.8 kb的BAM H I片段作为探针进行杂交，可在印迹上显示相应序列的限制性片段大小。

他的三个基因组克隆以千碱基对列出，用于Southern印迹分析。基因组DNA用BMH I限制性内切酶消化，并与32P标记的1.8千碱基HIS三个探针杂交，以显示这些诊断性片段。

0.8 千碱基 HIS 三 delta 201.7 千碱基 hiss 三 delta 三端 4 千碱基 T 3 15 5 千碱碱 T 15 三和 8 千碱基 hiss 三 delta 五端片段。泳道 A 为亲本二倍体。泳道 B 为 hiss 阳性非交互易位重组子，泳道 C 为 his 阳性交互易位重组子。

重组染色体BLO分析也可用于检测携带易位的克隆。将制备于琼脂糖小块中的完整染色体通过CHEF电泳分离，并用铱溴化物染色后在紫外光下观察。分离后的染色体被转印至尼龙膜，并与32P标记的1.8千碱基片段进行杂交。

他使用三种探针来可视化1.1兆碱基完整的15号染色体、15.8兆碱基的T15三号染色体易位染色体、0.6兆碱基的T三15易位染色体以及0.3兆碱基完整的三号染色体。A泳道为亲本型展开图，B泳道为his加非相互易位重组型，C泳道为his加相互易位重组型。

观看本视频后，您应能充分理解如何测定多次 ho 诱导的双链断裂后易位形成的频率。