芯片上的无透镜荧光显微镜技术

本实验的总体目标是展示一种无需透镜的片上荧光显微成像平台，用于在超大视场范围内对荧光物体进行成像。为实现这一目标，首先将一层薄的吸收滤光片和一块光纤面板轻轻放置在光电传感器阵列（即CCDC moss）表面，然后将微流控芯片置于面板之上。接着，通过使用折射率匹配油，将棱镜与微流控芯片组装在一起。

荧光激发通过菱形棱镜的侧表面实现，而全息照明则通过同一棱镜的顶表面完成。最终，可通过数字算法对采集到的荧光图像进行解码，从而获得高分辨率的显微图像。如有需要，可利用自主开发的界面自动计数解码后的荧光目标物体。

芯片上的透镜。成像技术的总体目标是利用更简单、更紧凑的设计，取代基于传统笨重透镜的光学显微镜。这一新兴技术平台有望借助新颖的理论和数字重构算法，消除对庞大且昂贵光学组件的需求。

芯片成像平台上的透镜组件列表包含多个光学部件，包括数字传感器阵列、非相干光源、棱镜、吸收滤光片以及光纤面板或光纤锥。在此平台上，可使用不同类型的传感器阵列来检测来自目标微小物体的荧光信号。在本视频中，将采用电荷耦合器件作为传感器阵列，并使用非相干光源（例如普通的发光二极管）进行荧光激发。

如图所示，采用两种不同的激发光滤光方法并行工作，以产生所需的暗场背景。首先，使用玻璃棱镜或玻璃半球在承载待测样品的微流控芯片底面产生全内反射（TIR）。与此同时，使用一种低成本的吸收滤光片去除不遵循全内反射过程的微弱散射激发光。

通过这两种机制成功抑制激发光后，探测器平面仅接收到样品的荧光发射信号。尽管探测数值孔径较大，传感器阵列上的原始荧光斑点仍会明显展宽，以利于设计并更好地控制该荧光信号的空间扩散。将在物平面与传感器平面之间放置一块光纤面板，作为常规面板的替代方案。

锥形光纤面板的顶端比底端具有显著更高密度的光纤电缆，可通过放大实现更高分辨率的成像。该平台所用的微流控芯片通过在玻璃载片上放置聚二甲基硅氧烷壁来制造，以形成片上成像所需的微通道，从而开始无透镜片上成像平台的组装。首先，使用真空笔移除光电传感器阵列的盖玻片，然后轻轻地将一层薄吸收滤光片放置在探测器感光区域的上方。

将光纤面板放置在该吸收滤光片上方。然后将制备好的微流控芯片直接置于光纤阵列之上。接着，使用折射率匹配油将玻璃棱镜组装在微流控芯片上方，使界面的折射率与玻璃的折射率相匹配。

使用 FC 连接器将光源连接到光纤电缆。该操作过程中最困难的环节之一是组件的对准。需仔细调整各组件之间的距离、照明位置及角度。

最后，将侧向照明光纤移近棱镜并调整其角度，以确保在对应于微流控芯片的玻璃-空气界面处发生全内反射。该芯片平台可用于成像底部基底、各种细胞或小型动物模型，但本演示中将以白细胞为成像对象。为用荧光染料标记白细胞，首先将约100微升全血与约1毫升红细胞裂解缓冲液混合，在室温下孵育约3分钟，然后离心裂解后的血液溶液。

使用微量移液器去除上层后，将沉淀层重悬于磷酸盐缓冲液中，以荧光染料标记细胞的核酸，在重悬液中加入SYTO 16，然后在室温避光条件下孵育约30分钟。孵育30分钟后，离心标记后的样品。去除上清液，以减少未结合染料的荧光发射带来的背景噪声。

Reese 已将约五毫升 PBS 加入白细胞沉淀层中并混匀。样品现已准备好，可加载至微流控芯片中，用于芯片上无透镜荧光成像。在对白细胞进行成像之前，必须使用荧光微珠对成像平台进行校准。

使用去离子水和原始微珠溶液制备稀释的微珠样品。使用带锐利针头的注射器，从PDMS壁侧面将该初始样品注入微流控芯片中。

组装好芯片上的荧光成像组件后，通过计算机使用自主开发的LabVIEW界面获取荧光微球的原始图像。务必检查在整个视场中至少有20个孤立的荧光微球图像。保存校准数据，后续将用于校准并提取无透镜荧光显微平台的点扩散函数。

取出含有荧光微球样品的微流控芯片，并将棱镜从该芯片上拆下。从PDMS侧壁注入先前制备的白细胞样品至另一个未使用的微流控芯片中。在相同的实验条件下重新组装各组件，特别是保持距离和激发功率一致。

使用与荧光微珠相同的软件参数，通过定制的实验室视图获取白细胞的原始图像。随后，在 MATLAB 中通过数字处理，利用校准数据和白细胞原始图像生成更高分辨率的图像。为便于比较，此处展示了宽场透镜荧光片上成像的结果，样本为含有 4 微米和 10 微米绿色荧光颗粒的混合物，成像放大倍数为 10 倍显微镜。

还提供了客观图像，这些图像与所示的无透镜荧光图像吻合良好。接下来是宽场无透镜荧光成像的结果，样品为含有10 µm绿色和10 µm红色荧光微粒的混合物。无透镜荧光图像与相同样品的10×显微镜物镜图像具有较好的一致性。

该图展示了 Lucy Richardson 去卷积与基于解码算法的压缩采样在成像多种 10 微米微珠对时的性能比较。第一行显示了无透镜的原始荧光图像，其中插图展示了使用 10 倍物镜所需的相同颗粒的显微镜对比图像。中间一行为压缩解码结果，最下面一行为 Lucy Richardson 去卷积结果。DDCS 和 DLR 分别表示中心到中心的距离以及显微镜图像、压缩采样解码的无透镜图像和 Lucy Richardson 去卷积处理的无透镜图像。

接下来，展示了对透镜的数字处理，以及荧光度较低的原始图像的处理方法。采用基于压缩采样的算法，通过分辨紧密排列的直径为两微米的微珠对，实现了空间分辨率小于四微米的效果。插图展示了40倍显微镜物镜的对比结果，与解码后的荧光图像高度一致。

此处 D 表示显微镜图像中的中心到中心距离，而 DCS 表示在 CS 解码透镜、荧光较弱的图像中的中心到中心距离。该图展示了荧光标记白细胞的无透镜成像结果。

利用基于压缩感知（CS）的解码器，可快速解码原始的无透镜图像，解码结果与使用10倍物镜获取的同一标本的传统显微镜图像高度一致。除了成像功能外，还可通过自主开发的片上流式细胞仪应用界面，自动计数解码后的荧光物体。图中展示的是在Matlab中定制设计的自动化荧光物体计数界面。我们刚刚演示了在8平方厘米视场范围内，对标记细胞和微珠进行无透镜荧光显微成像的操作流程。

这种成像平台结合了快速压缩解码器，将在高通量流式细胞术、微稀有样本分析以及活细胞研究应用中具有很高的可变性。