通过“过氧化”和“氧化”羟基自由基足迹法监测RNA结构的平衡变化

以下实验的总体目标是利用羟基自由基足迹法确定RNA分子的折叠方式。该过程首先对RNA进行末端标记、凝胶纯化和预折叠处理，以确保在后续依赖镁离子的折叠反应之前RNA构象的完整性。接着，混合芬顿试剂以产生羟基自由基，这些自由基可根据RNA骨架的溶剂可及性对其进行切割。随后，通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离RNA切割产物，并通过放射自显影进行检测。

通过半自动化的足迹分析软件对条带积分进行定量。最终目标是生成反映RNA三级结构形成的折叠等温线。这一步骤通过将归一化的条带积分按饱和分数进行缩放来实现。

随后可将等温线拟合到Hill方程。羟基足迹法的主要优势在于，利用廉价的化学试剂即可获得RNA的三级结构信息，由于小尺寸的羟基自由基具有较高活性，因此是区分溶剂可及与埋藏核苷酸的理想探针。该方法有助于解答RNA结构生物学领域中的关键科学问题。

例如，核糖体如何利用金属离子达到其活性构象？羟基自由基足迹法可用于理解RNA特异性和识别的基本原理。除了揭示RNA三级结构的信息外，该方法还可用于确定RNA或DNA分子中蛋白质的精确结合位点。

该方法的主要挑战在于防止核糖核酸酶导致的样品降解，以及优化铁浓度以获得适当的RNA切割程度。此外，对条带间距的详细分析也可能相当复杂。本视频的主要优势在于帮助观众理解羟基自由基足迹实验的规划阶段及成功实施的关键步骤。在开始本方案之前，应按照书面方案中的说明准备好所有足迹实验所需的试剂。

在此视频的配套实验中，可制备与DFOs相关的四种RNA，并按所述方法进行末端标记。使用变性凝胶电泳纯化放射性标记的RNA。通过两次连续的凝胶抽提，使用0.3摩尔的醋酸钠回收纯化后的RNA。

然后通过将0.5毫升水溶液与1毫升乙醇混合来沉淀RNA。将混合物在干冰上孵育1分钟。离心样品后，弃去上清液。用70%乙醇洗涤RNA沉淀。

额外离心后去除上清液，并在真空条件下干燥沉淀。随后，将纯化的 P 32 标记的 RNA 样品溶解。在新的反应管中，用移液器加入 330 微升 1 倍反应缓冲液和 30 微升 RNA 溶液。

用乙醇沉淀RNA，然后在真空条件下干燥沉淀。干燥后的沉淀可用于生成参考ladder，具体操作如书面实验步骤所述。将剩余的缓冲RNA溶液在95摄氏度加热2分钟以进行变性。将样品置于室温下15分钟，随后短暂离心，使冷凝液重新回到溶液中。开始足迹实验时，准备27个反应管，以获得足够填充30孔电泳胶的样品量。

加入分子量标记物和切割对照后，确定最终的镁离子和铁离子浓度，使其在滴定中点附近的多个数量级范围内以对数尺度均匀分布。文中将单独描述在1倍反应缓冲液中制备镁离子的步骤。将RNA与镁离子溶液在50摄氏度下孵育5分钟。然后取10微升RNA溶液与90微升相应浓度的镁离子溶液混合。

将每个混合物在50摄氏度下孵育30分钟，以达到100微升的终体积。随后，让溶液在25摄氏度下平衡1小时，以完成RNA折叠。在此期间，立即在启动羟基自由基足迹反应前，按照书面实验方案所述配制空白反应混合液。

在含有RNA溶液的反应管内壁顶部，用移液器分别加入两微升的铁-EDTA、抗坏血酸钠和过氧化氢液滴，使各液滴互不接触，以配制过氧化反应体系。通过剧烈混匀启动足迹反应。反应15秒后，加入300微升纯的冷乙醇终止反应。

将离心管轻轻翻转3至5次。最后，沉淀、洗涤并干燥沉淀物，操作步骤同前。作为过氧化反应的替代方法，可进行氧化羟基化反应，即向样品中加入5微升新配制的芬顿反应混合液。在25摄氏度下孵育氧化反应30分钟。

然后加入 300 µL 纯的冷乙醇以终止反应，并通过翻转离心管混匀。再次进行沉淀。在完成过氧化或氧化反应后，洗涤并干燥沉淀物。

将干燥的RNA沉淀溶解于8 µL的凝胶上样染料2中。使用盖革计数器确认P 32标记的RNA已重悬，然后根据标准方案制备变性的8%聚丙烯酰胺测序凝胶。使用30孔梳子上样样品，包括两个参照样品和一个已切割的对照样品。

在60至75瓦功率下分离RNA片段，持续两个半小时。将干燥的凝胶置于储存磷屏中避光曝光过夜。使用成像系统对磷屏进行扫描，实现无胶片自显影。

然后将凝胶图像文件转移至计算机进行分析。开始数据分析时，打开Safa——一款用于单条带拟合与定量的开源软件。首先加载RNA序列的点TXT文件，随后加载凝胶图像的点gel文件。

定义泳道并调整条带强度。然后选择一个锚定泳道，并以RNA的T1酶消化测序梯度为参照，将凝胶中各条带与相应核苷酸位置进行比对。量化条带强度，并利用归一化/着色图功能进行归一化处理，识别并标记可能不变的核苷酸残基。

将输出保存为 txt 文件。SFA 输出一个电子表格，其中列表示凝胶上的泳道，行表示对应 RNA 片段的各个条带积分值。首先，需通过比较无镁离子样品的保护图谱与终点镁离子浓度图谱，识别出溶剂可及性发生明显变化的保护位点。

数值越低，核苷酸对羟基自由基攻击的保护程度越高；反之亦然。接下来，使用电子表格格式，分别绘制条带强度随镁离子浓度变化的过渡曲线，或将单个或成组核苷酸的强度对镁离子浓度作图，并按照本实验方案文本部分所述，将这些过渡曲线各自缩放至分数饱和函数。最后一步，将数据拟合到Hill方程。

该分析将转变过程标度化为分数饱和度，确定转变的中点，并提供一种现象学方法来检验转变是否呈S形。以下是来自P四P六核糖体RNA羟基自由基足迹实验的代表性结果。等温曲线由通过Safa分析的测序凝胶数据得出，随后按照分析部分所述方法进行拟合。

凝胶图像表明，背景切割信号极低，且由于T泳道中条带清晰，可实现单核苷酸定位。RNA的羟基自由基诱导断裂信号显著高于背景。随着镁离子浓度由低到高转变，特定单一条带或条带群的信号强度选择性降低，表明RNA结构的形成。

三级结构保护是指一个或连续多个核苷酸，其切割会同时改变条带强度，通过Saffer分析对这些强度进行定量和归一化。结果以热图形式展示，直观显示核苷酸对羟基自由基的保护程度。颜色变化描述了在添加镁离子后核苷酸可及性的改变：从白色到红色表示核苷酸更易接近，而从白色到蓝色则表示核苷酸受到更强的保护。

每种程度的遮蔽都对应一个数值，该数值可绘制为保护曲线，并通过结合模型（如Hill方程）进行分析。在此示例中，保护位点1 5 3至1 5 5对应的平衡解离常数大约是保护位点1 6 3至1 6 4对应值的两倍。如果操作得当，该羟基自由基足迹实验可在一天半内完成。

进行该实验操作时，务必记得佩戴手套和实验服，以避免任何RNA污染。此外，最终的铁浓度取决于具体的实验体系。因此，我们建议在按照本方案进行足迹分析之前，先开展剂量反应实验。

其他方法，例如时间分辨的羟基自由基足迹法，也可用于回答更多问题。例如，RNA分子在生成后，在哪个关键时间点达到错误折叠或活性构象？该技术为结构生物学领域的研究人员探索核酸分子间的以及中间态的三级分子相互作用铺平了道路。

观看本视频后，您应该能够很好地理解如何确定 RNA 分子的三级结构形成。请注意，进行此操作时，钙和磷阶段二具有危险性，建议采取相应的安全预防措施，例如佩戴手套和护目镜，以及使用有机玻璃屏蔽装置。