利用 EpiAirway 模型表征长期宿主-病原体相互作用
2011年9月2日
该方法可用于表征扩展的细菌共培养体系与EpiAirways的相互作用，后者是一种在气液界面培养的原代人呼吸道上皮组织，具有生物学相关性 体外 模型。该方法可适用于任何能够进行长期共培养的微生物。
以下实验的总体目标是利用气液界面模型，对非分型流感嗜血杆菌（Nontypeable Hemophilus influenza，NTHI）与原代人呼吸道上皮组织进行长期共培养。该过程通过在上皮顶端表面接种NTHI，使细菌附着并侵入组织，作为第二步操作。每24小时使用预热的DPBS清洗插入式培养小室，以模拟正常的黏液流动，并清除黏蛋白代谢废物及任何细胞碎片。
接下来，在预定的时间点收获组织，测定与细胞相关或被细胞内化的NTHI的存活情况。最后，通过该方法可基于可存活细菌计数，评估NTHI在组织内存活随时间变化的菌株特异性特征。尽管该方法可用于深入了解非分型流感嗜血杆菌引起的长期感染。
它还可用于研究其他人类病原体，例如莫拉氏菌属的阿尔氏莫拉菌（Moraxella Alis）。演示本实验步骤的是我实验室的博士后研究员Dr. Doin ran。从包装中取出转运平板，准备开始实验。用70%乙醇喷洒转运平板，并将其放入生物安全柜中。
将一毫升四摄氏度的 Epi Airways 维持培养基加入六孔板的每个孔中。随后，移除封口膜，打开培养板，并取下覆盖在 Epi Airways 插件上的纱布。使用镊子以旋转动作将插件从 Aros 中取出。
如有需要，将插入物放入六孔板的其中一个孔中。使用无菌棉签小心地从插入物上移除 aros，避免触碰膜。确认插入物下方没有气泡滞留。
然后将六孔板放入培养箱中。每日按如下步骤清洗插入式培养小室：预热含钙和镁的DPBS，并用移液器吸取DPBS。然后使用无菌镊子轻轻夹起插入式培养小室，用移液器向组织上加入200 µL预热的DPBS。
然后轻轻晃动小室，使 DPBS 均匀分布，注意不要触碰组织。接着将小室倾斜一定角度，将 P1000 移液枪枪头紧贴插入底部固定膜的塑料环处。然后小心吸取缓冲液，并将溶液转移至冻存管中以备后续研究。
最后，吸除基础维持培养基，并加入一毫升新鲜培养基。预先将含钙和镁的DPBS加热至适宜温度。取三毫升预热的DPBS加入15毫升离心管中，然后将过夜在巧克力琼脂平板上生长的非分型流感嗜血杆菌或NTHI单菌落悬浮于该离心管中。
现在剧烈涡旋振荡试管至少10秒，然后测定光密度。继续逐个添加NTHI单菌落，直至细菌浓度达到约0.7的OD 600纳米值。接下来，用预热的DPBS如前所述洗涤每个EPI气道小室，然后向每个小室的顶端表面加入28 µL细菌悬液。
避免将接种物接种到基础维持培养基中。然后将平板放回培养箱中，对NTHI进行定量前，先预热并使巧克力琼脂平板表面干燥。接下来，使用含0.1%明胶的无菌PBS（PBSG）对NTHI接种物进行连续稀释。
取10微升接种物滴加到平板上，然后在5%二氧化碳环境中37摄氏度下过夜培养。次日，通过计数每个液滴中具有15至30个独立菌落的稀释度，反向计算出实际的NTHI活菌接种量，以收获与细胞相关的总细菌数。用200微升不含钙和镁的DPBS冲洗epi airway的顶面三次。
然后倾斜小室，冲洗掉基底膜上残留的维持培养基。将清洗后的小室放入新的六孔板中，并在每块组织的顶侧表面加入 250 µL 无菌的 1% 皂苷溶液。在板子孵育期间，将板放回培养箱中孵育 10 分钟。
准备一系列稀释管，每管加入900微升PBSG。接着，使用P1000移液器吸头以来回运动的方式从膜上刮取组织，再以环形运动清除插入膜边缘的组织。然后，使用无菌的大孔径P1000移液器吸头将悬液转移至一个空的1.5毫升离心管中。
现在向插入物的顶端表面加入 250 µL DPBS，然后使用倒置相差显微镜观察插入物，以确定是否仍有组织需要收获。将悬液加入离心管中，并迅速加入 500 µL DPBS 至管顶。涡旋振荡细胞悬液 1 分钟。
然后使用带有26号针头的无菌1毫升注射器，通过针头将悬液吸入注射器内。缓慢地将悬液通过针头推注三次，注意避免产生气泡。
然后剧烈涡旋振荡悬浮液一分钟。接着，使用大孔径移液器吸头将100 µL悬浮液转移至第一个稀释管中。剧烈涡旋振荡该管五秒钟，然后进行10倍系列稀释，并将稀释液滴加到巧克力琼脂平板上进行涂布。
然后将培养板在37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育过夜，以进行活菌计数并收获内化细菌。每个插入物仅用200微升DPBS洗涤三次。将基础维持培养基更换为含有100微克/毫升硫酸庆大霉素的培养基，然后向顶端表面加入300微升含庆大霉素的维持培养基。
将插入物放回培养箱中孵育一小时，同时在插入物孵育期间将一些DPBS预热。然后从顶端表面移除含有庆大霉素的维持培养基。接着，用预热的DPBS对插入物的顶端表面和基底膜进行充分洗涤。
最后，在进行本图中胞内细菌的系列稀释与涂板操作前，重复上述展示的清洗与收获步骤。比较左侧未感染的epi呼吸道组织与右侧感染五天非典型流感嗜血杆菌（NTHI）的epi呼吸道组织的扫描电子显微镜图像可以看出，长期共培养NTHI并未导致顶端组织出现明显损伤，凸显了epi呼吸道模型的应用价值。
此处显示了在气-液界面共培养过程中，随时间推移被细胞内化的NTHI数量的图表。接种R 2 8 6 6菌株的浓度约为每插入膜1 × 10⁷ CFU。随后在各个指定时间点收集并计数内化细菌。
观看本视频后，您应能充分掌握如何利用气液界面模型对非典型流感嗜血杆菌与原代人呼吸道上皮组织进行长期共培养。
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概述
该方法可用于表征扩展的细菌共培养与EpiAirways（一种使用原代人呼吸道上皮组织的、具有生物学相关性的体外模型）之间的相互作用。此方法可适用于任何适合长期共培养的微生物。
关键研究组成部分
科学领域
- 微生物学
- 呼吸生物学
- 体外模型
背景
- 非分型流感嗜血杆菌（NTHI）是呼吸道感染中的重要病原体。
- 了解细菌与呼吸道上皮组织的相互作用对于开发治疗方法至关重要。
- EpiAirways 模型可模拟人类气道环境。
- 长期共培养研究有助于深入了解细菌的存活与行为特征。
研究目的
- 进行NTHI与原代人呼吸道上皮组织的长期共培养。
- 评估NTHI在组织内存活的时间动态。
- 分析NTHI存活的菌株特异性特征。
使用的方法
- 用NTHI接种上皮组织的顶面。
- 每24小时用预热的DPBS清洗插入物，以模拟黏液流动。
- 在预定时间点收获组织用于分析。
- 测定与细胞总体相关或内化NTHI的存活情况。
主要结果
- 获得了关于NTHI长期感染的新见解。
- 采用可存活细菌计数来评估NTHI的存活特性。
- 该方法证明了在相关模型中评估细菌行为的能力。
- 研究结果可为未来呼吸道感染的研究提供参考。
结论
- 该方法为研究细菌与人类呼吸组织的共培养提供了有价值的工具。
- 它有助于深入理解NTHI与上皮细胞之间的相互作用。
- 该方法可适用于类似研究中的其他微生物。
常见问题
行业重要性概述
EpiAirway 模型可实现呼吸道病原体与原代人类上皮组织的长期共培养，填补了临床前感染建模中的关键空白。该方法有助于解析宿主-病原体相互作用的机制并降低相关风险，提高早期抗菌靶点验证的预测可靠性。通过在较长时间内维持组织完整性和生理相关性，该模型增强了从发现阶段到临床前开发的转化连续性。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 科学价值：通过随时间定量细胞相关和细胞内化细菌，实现对治疗假设的验证。
- 操作价值：通过在与人类相关的系统中评估菌株特异性存活特征，支持功能靶点的验证。
- 科学价值：通过模拟浸没培养无法支持的慢性感染表型，促进生物学风险的降低。
筛选与检测方法开发
- 科学价值：提供定量的因变量测量结果（菌落形成单位计数），用于评估抗菌效果和细菌持留性。
- 操作价值：通过每日使用预热的DPBS清洗，模拟黏膜纤毛清除作用，减少实验变异性，从而实现检测方法的标准化。
- 科学价值：支持筛选准备工作，允许将黏蛋白产生和细胞因子谱分析作为宿主反应的次要检测指标。
转化与临床前研究
- 科学价值：采用与疾病相关的系统（正常人支气管上皮细胞），提高呼吸道感染中转化生物标志物的一致性。
- 操作价值：通过在长期共培养过程中维持组织结构和功能，确保从发现到临床前研究的连续性。
- 科学价值：在不造成显著顶侧组织损伤的情况下，通过表征长期宿主-病原体相互作用，支持基于风险评估的推进决策。
流程与工作流整合
该方法适用于从早期靶点验证到临床前药效测试的发现全过程，尤其适用于呼吸道抗微生物药物的开发。
- 发现生物学：通过实现对细菌黏附、侵袭和存活的长期追踪，支持假设验证和通路阐明。
- 筛选：通过标准化的接种物制备（OD 600 nm ~0.7）和系列稀释平板法进行活菌计数，提供检测就绪性和可重复性。
- 分析：生成定量读数（CFU/mL），可用于比较菌株特异性存活能力以及评估干预措施的效果。
- 转化研究：利用保留细胞因子产生和黏液分泌能力的人原代组织，实现与临床前研究的衔接。
- 企业级复用：该平台可重复使用，并可扩展应用于NTHi以外的其他呼吸道病原体（例如，Moraxella catarrhalis）。
运营与企业影响
- 科学价值：通过降低慢性感染模型中的机制模糊性，提高靶点验证的预测可信度。
- 操作价值：采用无抗生素条件和明确定义的洗涤方案，实现标准化与可重复性。
- 战略价值：通过识别随时间推移减少细菌内化或持续存在的化合物，实现更优的立项/终止决策。
- 项目组合影响：基于长期感染动态而非急性细胞毒性终点进行风险调整后的优先级排序。
实施注意事项
- 需要具备原代组织处理经验以及在生物安全二级条件下进行细菌与人类细胞共培养的操作技能。
- 依赖于专用的培养插件和气液界面培养系统（例如 MatTek EpiAirway）。
- 需要跨团队对接种物制备、清洗频率和收获流程进行标准化。
- 适应性考虑因素包括病原体与黏液纤毛清除模拟系统相容性的验证，以及随时间推移对组织完整性的评估。
- 实际限制：延长共培养时间会增加污染风险，因此在共用的生物安全柜中操作时必须严格执行无菌技术。
